波形蛋白與PRRSV核衣殼蛋白及新型受體蛋白的關(guān)系.pdf

1、根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Marc-145細(xì)胞中波形蛋白的全基因序列使用DNA-Star軟件設(shè)計(jì)-對特異性引物 V1:5’-CAGCCATGACCACCAGG-3’,V2:5’-AAGGTCAAGACGTGCCAG-3’送交引物合成公司合成,利用常規(guī)提取RNA方法從Marc-145細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA然后通過RT-PCR方法擴(kuò)增出長度為1401bp的波形蛋白全基因片段；經(jīng)過質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定將陽性菌送交測序公司測序,經(jīng)過比對

2、證明擴(kuò)出的序列為波形蛋白全基因序列；合成帶有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物,通過質(zhì)粒PCR獲得PCR產(chǎn)物膠回收PCR產(chǎn)物,雙酶切膠回收產(chǎn)物和載體pET28a后用T4連接酶連接,經(jīng)過鑒定成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體pET28a-Vimentin；將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá),獲得分子質(zhì)量為57Kd的重組表達(dá)蛋白,經(jīng)過Western—blot進(jìn)一步驗(yàn)證重組波形蛋白成功表達(dá)。周恩民教授通過免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說,制備出抗PRRSV GP

3、5蛋白的抗獨(dú)特性抗體5G2,5G2是GP5蛋白的鏡影像,能夠模擬GP5蛋白的功能,通過IP實(shí)驗(yàn)成功得到了一個新型受體蛋白命名為5號受體,通過重復(fù)IP實(shí)驗(yàn)得到新型受體蛋白,經(jīng)電洗脫得到純化的新型受體蛋白。
　　 I-ELISA方法證明表達(dá)的重組波形蛋白與PRRSV的核衣殼蛋白N蛋白結(jié)合而不與囊膜蛋白GP5蛋白結(jié)合,同時I-ELISA方法也證明重組表達(dá)的波形蛋白與提純的新型受體蛋白結(jié)合。
　　 以純化的重組波形蛋白做免疫原免

4、疫BALB/c小鼠,制備出抗重組波形蛋白的陽性血清,用I-ELISA方法檢測陽性血清抗體效價(jià),顯示陽性血清稀釋到1:10萬時A450的值大于未免疫小鼠血清的A450的值即P/N>2.1說明免疫小鼠產(chǎn)生了抗重組波形蛋白的抗體即得到了抗波形蛋白的高免血清,IFA試驗(yàn)證明此陽性血清能夠與PRRSV易感的Marc-145細(xì)胞結(jié)合；通過病毒阻斷試驗(yàn)證明抗重組波形蛋白的鼠陽性血清在稀釋度為1:10和1:20,PRRSV的加入量為每孔100TCID5

5、0能有效阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:波形蛋白得到成功表達(dá),重組波形蛋白能夠與PRRSV的N蛋白結(jié)合,而不與GP5蛋白結(jié)合,進(jìn)一步說明重組波形蛋白是PRRSV的受體之一；通過I-ELISA方法證明重組波形蛋白與提純出的新型受體蛋白結(jié)合。對PRRSV受體的研究有助于揭示PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互關(guān)系,有助于闡明PRRSV的融合和進(jìn)入易感細(xì)胞的過程,更有助于揭示PRRSV的致病機(jī)制,從而對于PRRSV