殺蟲抗病增效蛋白HaCad1和MgAp1的活性及作用機(jī)理.pdf

1、本論文主要著眼于蘇云金芽胞桿菌在殺蟲抗病相關(guān)領(lǐng)域的研究,研究內(nèi)容分別涉及到了該領(lǐng)域的多個(gè)方面:包括對(duì)具有殺蟲抗病增效作用新基因的發(fā)掘,功能和作用機(jī)理研究；具有殺蟲抗病增效作用新基因在蘇云金芽胞桿菌中的功能驗(yàn)證；還有蘇云金芽胞桿菌遺傳操作方法的改進(jìn)；以及轉(zhuǎn)基因Bt工程菌的安全性問題的評(píng)估等等。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1)HaCadl對(duì)蘇云金芽胞桿菌毒素CrylAc的增效活性及其增效機(jī)理
　　 本研究將純化的HaCa

2、dl與CrylAc毒素進(jìn)行體外復(fù)配生測(cè),發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲受體鈣粘蛋白含有毒素結(jié)合區(qū)域的片段HaCadl能夠顯著提高殺蟲晶體蛋白CrylAc對(duì)棉鈴蟲的殺蟲活性。本研究進(jìn)一步研究了HaCadl對(duì)CrylAc毒素的增效機(jī)理,證明體外添加的HaCadl可以在中腸環(huán)境下促進(jìn)毒素單體的寡聚化,這樣可以提供更多的寡聚化的毒素,提高毒素與第二受體結(jié)合的比例,最終起到提高殺蟲活性的功能。
　　 2)蘇云金芽胞桿菌毒素CrylAc與棉鈴蟲受體鈣粘蛋白Ha

3、Cad的相互作用位點(diǎn)
　　 本研究通過構(gòu)建了一系列的棉鈴蟲鈣粘蛋白毒素結(jié)合區(qū)HaCadl的N端和C端的缺失突變體,然后對(duì)各缺失突變體采用ligand blot,GST-Pulldown和酵母雙雜交等蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)研究了它們與CrylAc毒素的結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HaCadl上能夠與CrylAc蛋白結(jié)合的位點(diǎn)位于1401位到1441位之間的40個(gè)氨基酸殘基內(nèi)。進(jìn)一步對(duì)該區(qū)域進(jìn)行3個(gè)氨基酸殘基的丙氨酸掃描突變實(shí)驗(yàn)證明其中的

4、1416FIL1418和1422TGVLSLNFOPTAAMHGMFEF1441多肽對(duì)于受體結(jié)合毒素是必須的。同時(shí),通過對(duì)CrylAc蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ內(nèi)的loop-1,loop-2,loop-3和loop-α8的缺失突變體與HaCadl的ligandblot實(shí)驗(yàn),證明CrylAc蛋白與HaCad結(jié)合的區(qū)域位于結(jié)構(gòu)域Ⅱ內(nèi)的loop-3區(qū)域。最后,通過序列比對(duì),親水性互補(bǔ)分析和三維結(jié)構(gòu)對(duì)接模擬進(jìn)一步證實(shí)CrylAc結(jié)構(gòu)域Ⅱ中l(wèi)oop3的區(qū)域44

5、0FSNSSVSII448和受體HaCad上的1423GVLSLNFQP1431區(qū)域是發(fā)生相互作用的核心區(qū)域。
　　 3)稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl誘導(dǎo)植物抗病活性和作用機(jī)理
　　 本研究在大腸桿菌中表達(dá)和純化了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl,通過室內(nèi)盆栽抗病等實(shí)驗(yàn)證明了MgApl具有蛋白類激發(fā)子的功能,能夠誘導(dǎo)包括水稻,番茄和土豆等多種植物產(chǎn)生對(duì)多種細(xì)菌和真菌病害的抗性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MgApl蛋白能夠誘導(dǎo)番茄葉片中抗病相

6、關(guān)酶的積累和活性的顯著提高。通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MgApl蛋白能夠誘導(dǎo)水稻葉片中抗病相關(guān)基因PRs表達(dá)的上調(diào),而且這種上調(diào)現(xiàn)象具有可傳導(dǎo)性和長達(dá)15 d的持效期。說明MgApl蛋白誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的抗性是一種系統(tǒng)獲得抗性SAR。之后通過對(duì)SAR各條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的標(biāo)志基因和條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的突變體等試驗(yàn)進(jìn)一步證明了MgApl主要是通過水楊酸途徑來進(jìn)行SAR的信號(hào)傳導(dǎo)。此外還證明MgApl的誘導(dǎo)過程還與鈣離子通道和活性氧的進(jìn)發(fā)有關(guān)。
　

7、　 4)稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl增強(qiáng)AiiA蛋白和ZwA的抗病活性
　　 本研究通過將S-層表面展示系統(tǒng)在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171中成功表達(dá)了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl,并通過室內(nèi)盆栽和離體抗病試驗(yàn)證明了MgApl具有誘導(dǎo)番茄抗病相關(guān)酶活性提高和誘導(dǎo)馬鈴薯抗軟腐病等生物學(xué)功能。本研究進(jìn)一步探索了稻瘟菌蛋白類激發(fā)子MgApl、AiiA蛋白與ZwA之間進(jìn)行聯(lián)合抗病的可能性。將MgApl、AiiA蛋白的編碼基因s

8、lh-mgap1和pro3a-aiia同時(shí)導(dǎo)入到高產(chǎn)ZwA的蠟狀芽胞桿菌UW85中,得到了同時(shí)表達(dá)MgApl、AiiA蛋白與ZwA的重組菌。室內(nèi)盆栽結(jié)果發(fā)現(xiàn)共表達(dá)重組菌獲得了MgApl的誘導(dǎo)活性,Aii活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組菌也獲得AiiA蛋白對(duì)AHLs信號(hào)分子的降解活性。同時(shí)ZwA活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共表達(dá)并不影響重組菌中ZwA的產(chǎn)量。最后,離體抗病實(shí)驗(yàn)證明三者在芽胞桿菌中共表達(dá)能夠極大地提高重組菌對(duì)軟腐病菌SCG1的防治效果。
　　 6)

9、蘇云金芽胞桿菌工程菌BMB696B和BMB606B的安全性毒理學(xué)評(píng)估
　　 本研究按照《農(nóng)藥登記毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》GB15670-1995上規(guī)定的關(guān)于生物農(nóng)藥的毒理學(xué)內(nèi)容和方法,完成了工程菌BMB606B和BMB696B的急性和亞急性毒性,眼和皮膚刺激性以及過敏性等毒理學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果證明工程菌BMB696B和BMB606B及其產(chǎn)品對(duì)雌、雄性大鼠(Wistar)急性經(jīng)口LD50大于5000 mg/kg,屬低毒類；對(duì)雌雄大鼠急性經(jīng)皮LD

10、50大于2000 mg/kg,屬低毒類；對(duì)兔眼刺激積分指數(shù)為0,刺激平均指數(shù)48 h后為0,眼刺激強(qiáng)度為無刺激性；對(duì)雌雄大鼠經(jīng)過多次致敏和激發(fā)均沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)封閉群豚鼠有皮膚的致敏反應(yīng),屬Ⅰ級(jí)弱致敏物；經(jīng)28 d致病性觀察,在經(jīng)口劑量5000 mg/kg情況下,對(duì)雌雄Wistar大鼠體重,取食,飲水,血常規(guī)和血清學(xué)指標(biāo)以及器官發(fā)育均無明顯影響,說明兩株工程菌產(chǎn)品對(duì)受試動(dòng)物無致病作用。本研究證明工程菌BMB696B和BMB606B及其產(chǎn)品對(duì)所

11、試動(dòng)物無毒、無刺激性、無致敏性、無致病性,是值得進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的安全可靠的生物殺蟲劑。
　　 6)蘇云金芽胞桿菌野生菌和大質(zhì)粒高效電轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 本研究通過DNA脫鹽技術(shù)處理外源DNA,加入細(xì)胞壁弱化劑弱化蘇云金芽胞桿菌的細(xì)胞壁,并對(duì)各種影響電轉(zhuǎn)化效率的因素的條件優(yōu)化,建立了一套蘇云金芽胞桿菌的高效電轉(zhuǎn)化體系。與已報(bào)道的最佳的電轉(zhuǎn)化程序比較,結(jié)果證明:本研究優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使BMB171的電轉(zhuǎn)化效率提高了104倍