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1、PA1b(豌豆白蛋白1b)是一37 個(gè)氨基酸單鏈多功能的生物活性肽,于1986 年首次從豌豆種子中分離與鑒定,其第3、7、15、20、22、和32 位點(diǎn)的氨基酸殘基為半胱氨酸。它廣泛分布于豆科植物中,是一種熱穩(wěn)定性,抗胃蛋白酶、胰蛋白酶水解的生物活性肽。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的主要功能有:1)昆蟲(chóng)毒劑,可殺滅谷類象鼻蟲(chóng),對(duì)人和環(huán)境沒(méi)有危害;2)在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)愈傷組織的生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞分裂;3) 具有調(diào)節(jié)血糖的作用,當(dāng)注射劑量為5μg/g
2、體重時(shí),PA1b 能顯著提高正常昆明小白鼠和II 型糖尿病模型鼠的血漿葡萄糖濃度。當(dāng)注射劑量為2.5μg/g 體重時(shí)能明顯降低I 型、II 型糖尿病模型鼠的血漿葡萄糖濃度。 有關(guān)三級(jí)結(jié)構(gòu)研究顯示它屬于一種半胱氨酸結(jié)的肽類,被命名為cyclotides,有這種結(jié)構(gòu)的肽因?yàn)榫哂袧撛诘目股睾涂拱澆〉奶匦远鴤涫荜P(guān)注。 該肽在植物體內(nèi)參與生長(zhǎng)和代謝的調(diào)節(jié),其作用模式與動(dòng)物體內(nèi)胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子作用類似。它在大豆種子中可結(jié)
3、合7S Bg 蛋白,7S Bg 蛋白又可以結(jié)合動(dòng)物胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子。故PA1b 又名為L(zhǎng)eginsulin,Leginsulin 有催化7S Bg 蛋白磷酸化的作用。 為了進(jìn)一步研究PA1b 分布與功能,及其可能與動(dòng)物胰島素系統(tǒng)之間存在的某種關(guān)系,我們制備了抗PA1b 的單克隆抗體及多克隆抗體,作為對(duì)該肽深入研究的重要工具。從豌豆種子中經(jīng)純化鑒定得到PA1b 后,采用戊二醛二步法將PA1b 連結(jié)在載體蛋白牛甲狀腺球蛋白(
4、BTG)上,用該連結(jié)物作為免疫原。用碳二亞胺作交連劑,將PA1b 連結(jié)在載體蛋白人血清白蛋白(HAS)上,用此連結(jié)物作檢測(cè)抗原。 通過(guò)皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c 小鼠、免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合、經(jīng)ELISA 方法對(duì)陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選、并用有限稀釋法對(duì)分泌抗PA1b 抗體的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行多次克隆,得到5 株能穩(wěn)定分泌抗PA1b 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為H9、F6、E5、C7 及A10。通過(guò)小鼠腹腔注射陽(yáng)性細(xì)
5、胞擴(kuò)大培養(yǎng)、采集腹水和用辛酸-硫酸胺對(duì)腹水進(jìn)行純化得到了較純的單克隆抗體。并對(duì)抗體的亞類(亞型)、效價(jià)、特異性和親和力進(jìn)行了分析,它們屬于IgG1 和IgG2b 亞類,輕鏈均為κ鏈,有較好的特異性和較高的親和力。同時(shí)通過(guò)免疫新西蘭大白兔、收集血清并進(jìn)行純化獲得了較好的多克隆抗體。 應(yīng)用以上制備的抗體,建立了一種檢測(cè)PA1b 的竟?fàn)幰种艵LISA 方法,這種方法有比用放射性物質(zhì)標(biāo)記的放射免疫分析法的優(yōu)越性,它是通過(guò)酶標(biāo)記二抗來(lái)對(duì)抗
6、原進(jìn)行定量分析。在這種方法中,對(duì)抗原的結(jié)構(gòu)沒(méi)有任何破壞。通過(guò)一系列已知濃度的PA1b 作標(biāo)準(zhǔn),建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,它檢測(cè)PA1b 的最小檢測(cè)極限為15nmol/L,線型范圍在15nmol/L~730nmol/L 之間。為了評(píng)價(jià)這種ELISA,通過(guò)比較批內(nèi)與批間檢測(cè)到的PA1b 量,對(duì)批內(nèi)與批間的差異進(jìn)行了分析,這種方法平均批內(nèi)差異為2.81%,批間差異為6.74%,回收率分別是在97.44~103.84%和94.87~102.72%之間。
7、 用上述方法檢測(cè)了PA1b 在多種植物和小鼠的組織中的分布,發(fā)現(xiàn)PA1b 不但在多中植物中分布,而且在小鼠的某些組織中也存在,這個(gè)結(jié)果被免疫組織化學(xué)、免疫印跡所進(jìn)一步證實(shí),這是首次證實(shí)PA1b 跨界存在,開(kāi)拓了對(duì)這一重要多肽激素研究的新領(lǐng)域。另外也發(fā)現(xiàn)了在豌豆種子發(fā)芽中PA1b 含量的變化規(guī)律。 為了研究PA1b 對(duì)血糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理,用表面等離子共振生物傳感器、原子力顯微鏡等技術(shù),對(duì)動(dòng)物組織中是否存在與PA1b 相互作用
8、蛋白進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物胰腺組織的細(xì)胞膜上有與PA1b 相互作用的蛋白。并采用親和層析的方法從豬胰腺細(xì)胞膜上純化得到了該蛋白。用ELISA 實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)蛋白能夠與PA1b 結(jié)合。通過(guò)SDS-PAGE 分離、膠內(nèi)胰酶水解、MALDI-TOF-MASS 鑒定后獲得這個(gè)蛋白的肽指紋圖譜。依據(jù)肽指紋圖譜在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com)中用Mascot Search 匹配比較,發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)電壓
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