基于免疫傳感器對β-受體激動劑類獸藥殘留的快速現(xiàn)場檢測研究.pdf

1、本論文制備了一系列用于模擬生物探針的主客體吸附材料，在此基礎(chǔ)上結(jié)合夾心免疫分析方法，開發(fā)了多種低成本、簡單、高靈敏、高特異性的免疫分析方法，實現(xiàn)了對萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）的高靈敏痕量檢測，具體如下：利用膠體鉑的生物相容性合成 PtNPs-PV作為信號探針，通過PtNPs標(biāo)記 PV（PowerVision）來代替?zhèn)鹘y(tǒng)試劑盒的酶標(biāo)抗體，共同催化底物二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）產(chǎn)生顏

2、色反應(yīng)，以達到雙重放大效果，構(gòu)建光化學(xué)免疫傳感器，實現(xiàn)食品中 RAC痕量殘留的快速、靈敏、高特異性檢測。合成磁性β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）代替抗體捕獲樣品中的目標(biāo)物，再結(jié)合 PtNPs-PV雙重信號放大效應(yīng)，通過夾心免疫光化學(xué)分析的方法完成 RAC的檢測，該方法避免了競爭型免疫分析易發(fā)生假陽性的缺點。合成磁性β-CD代替抗體作為捕獲探針，膠體金富集辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，H

3、RP）合成 enzyme-AuNPs作為信號探針，用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸（TMB）為底物放大信號，基于TMB沉淀和RAC的質(zhì)量之間的比例關(guān)系，通過運用石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）測量enzyme-AuNPs復(fù)合物催化 TMB沉淀的數(shù)量，可以實現(xiàn) RAC的量化。以酶-抗體的共軛聚合物 PV試劑作為信號標(biāo)簽，F(xiàn)e3O4@β-CD磁性納米顆粒作為RAC的捕獲探針，以TMB作

4、為底物放大反應(yīng)信號合成了一種免修飾 QCM免疫傳感器來檢測飼料中微量的RAC殘留。上述分析方法大大降低了實驗成本，簡化了實驗步驟，增強了檢測靈敏度，為 RAC的現(xiàn)場檢測提供了理論依據(jù)。
　　本論文主要從下述4個方面開展研究工作：
　　1.基于PtNPs-PV的雙重放大免疫比色法檢測肉中 RAC痕量殘留的研究
　　提出了一種免疫比色方法用于檢測食品中 RAC的殘留。該方法結(jié)合了抗原抗體特異性結(jié)合的高選擇性特點和膠體鉑顆粒

5、與多聚酶螯合物（PtNPs-PV）的信號放大效應(yīng)，能特異、靈敏地檢測樣品中痕量的RAC殘留。多聚酶螯合物 PV上含有抗抗體和大量的HRP酶，與抗體特異結(jié)合的同時催化底物 DAB產(chǎn)生顯色沉淀，并且膠體鉑顆粒（PtNPs）也能催化 DAB產(chǎn)生顯色復(fù)合物，從而達到雙重放大效果。通過測定 DAB反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的變化能對應(yīng)計算樣品中RAC的殘留量。結(jié)果表明，在優(yōu)化的測定條件下，該方法具有較高的檢測靈敏度并在0.05-20 ng mL-1范圍內(nèi)具有

6、良好的相關(guān)性，R2=0.992，檢測下限是0.025 ng mL-1。所提出的方案具備靈敏度高、選擇性強、準(zhǔn)確性高且檢測速度快等優(yōu)點，可以適應(yīng)食品中 RAC殘留的現(xiàn)場檢測需求。
　　2.基于PtNPs-PV作為信號探針、Fe3O4@β-CD作為捕獲探針的光化學(xué)免疫傳感器對豬肉中 RAC檢測的研究
　　該 RAC的酶聯(lián)免疫檢測方法，利用 Fe3O4@β-CD作為捕獲探針、膠體鉑顆粒和多聚酶螯合物 PV的復(fù)合物 PtNPs-PV

7、為信號探針，以PtNPs-PV對顯色底物 DAB的雙重催化得到的DAB顯色產(chǎn)物通過酶標(biāo)儀測定吸光度。所測得的吸光值與 RAC濃度呈正相關(guān)。在最適條件下，吸光度與 RAC的濃度是成比例的，范圍從0.01到8.1 ng mL-1。以PtNPs-PV復(fù)合物作為信號探針的競爭性免疫比色法對 RAC的檢測限為0.01 ng mL-1，該檢測限比市售試劑盒的提高了10倍左右。
　　3.基于enzyme-AuNPs作為信號探針以磁性β-CD為吸

8、附的QCM免疫傳感器用于快速檢測食品中的RAC
　　基于QCM的利用 enzyme-AuNPs酶放大的生物傳感器，可以高靈敏檢測食品中的RAC。并且通過enzyme-AuNPs信號放大策略和磁性β-CD的富集作用實現(xiàn)了高靈敏檢測。這種新型的QCM免疫傳感器結(jié)合了免疫檢測具有的高度選擇性和QCM的高靈敏度，已被用于檢測食品生產(chǎn)中微量殘留的RAC。在最適條件下，QCM的頻率差異是與 RAC的濃度成比例的，范圍從0.01到10 ng m

9、L-1。QCM傳感器最低檢測限為0.01 ng mL-1。由于其高靈敏度，可接受的穩(wěn)定性和良好的選擇性，免疫傳感器實現(xiàn)了RAC在食品中可靠的量化。該項目在食品安全方面，具有成為一個成功的現(xiàn)場篩查方法的潛能。
　　4.一種基于生物共軛聚合物和磁性β-CD的QCM免疫傳感器用于RAC的快速檢測
　　本章開發(fā)了一種利用酶擴增的磁性免疫傳感器—— QCM超靈敏和特異地檢測飼料中的RAC。為了富集 RAC，酶擴增磁性免疫傳感器的磁捕獲

10、探針是通過將β-CD固定在氨基化的Fe3O4納米粒子上獲得的。PV是一種具有很高的酶/抗體比的高聚酶復(fù)合物，常作為信號標(biāo)簽使用。存在于夾層式免疫反應(yīng)所生成免疫復(fù)合物 HRP酶中，能引起過氧化底物 TMB生成大量的沉淀，并且這些沉淀與目標(biāo)檢測物 RAC的含量成比例。PV上存在的大量 HRP酶可較高地放大 QCM傳感器的信號。在最適條件下，QCM的頻率隨 RAC濃度的不同而變化，在0.03到25 ng mL-1之間該頻率變化與 RAC濃度成