產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶與菊粉乙醇發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、目的:本研究從新疆石河子地區(qū)菊芋根部土壤中分離，篩選純化得到產(chǎn)菊粉酶菌株，對(duì)其進(jìn)行60Co誘變使其產(chǎn)酶活力提高，通過(guò)篩選得到一株高產(chǎn)菊粉酶菌株，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。結(jié)合啤酒酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵，經(jīng)過(guò)60Co誘變選育出高產(chǎn)菊粉酶活的菌株，并確定菊芋乙醇發(fā)酵確定最佳培養(yǎng)條件，從而為菊芋乙醇工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:（1）采集菊芋根部土壤，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用平板法和有限稀釋法進(jìn)行產(chǎn)菊粉酶菌株的分離純化。（2）

2、對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，選取一株產(chǎn)菊粉酶的菌株進(jìn)行60Co誘變選育，獲得一株高產(chǎn)菊粉酶菌株。（3）設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)，根據(jù)Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇顯著影響因子，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定顯著影響因子的中心點(diǎn)，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果作為Central Composite Design（CCD）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)

3、驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert8.0軟件及origin8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理和作圖。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功的從新疆石河子市地區(qū)菊芋生長(zhǎng)的鹽堿地中，使用有限稀釋法經(jīng)過(guò)平板稀釋涂布、挑取單菌落經(jīng)過(guò)劃線(xiàn)培養(yǎng)，得到12株能夠產(chǎn)生菊粉酶的菌株。對(duì)獲得的菌株所產(chǎn)菊粉酶酶活進(jìn)行測(cè)定，其中有一菌株所產(chǎn)菊粉酶具有較高酶活，其酶活達(dá)到17.2U/mL，將此菌株命名為G-60。以菌株G-60為產(chǎn)菊粉酶出發(fā)菌株，進(jìn)行60Co

4、誘變，使其產(chǎn)菊粉酶能力提高。
　　2.分別選取0Gy、8000Gy、1000Gy和12000Gy劑量的60Co對(duì)菌株G-60進(jìn)行照射誘變。經(jīng)過(guò)60Co照射誘變后，分別取100ul誘變孢子懸液，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后涂平板篩選出正向突變株，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后測(cè)定其產(chǎn)酶能力達(dá)到31.1U/mL是誘變前17.2U/mL的1.8倍，將其命名為G-60’。
　　3.菌株G-60’產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，在Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基

5、礎(chǔ)上，運(yùn)用最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定Central Composite Design（CCD）響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)中心，對(duì)菊粉濃度、蛋白胨以及裝液量三個(gè)影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立了菌株 G-60’所產(chǎn)菊粉酶酶活的二次多項(xiàng)式回歸模型，通過(guò)響應(yīng)面法分析了該模型的有效性和可靠性與各因素之間的交互作用，獲得了菌株 G-60’所產(chǎn)菊粉酶酶活的優(yōu)化工藝條件為：菊粉66.5g/L、蛋白胨29.1g/L以及裝液量49.4mL。在此工藝條件下，菌株G-

6、60’所產(chǎn)菊粉酶酶活力達(dá)到67.8/mL，與優(yōu)化前菌株G-60’所產(chǎn)菊粉酶酶活力31.1U/mL相比較提高了2.18倍。
　　4.以菌株G-60’為產(chǎn)酶菌株，啤酒酵母為乙醇發(fā)酵菌株，進(jìn)行菊粉乙醇發(fā)酵，采用Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及Central Composite Design（CCD）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，使乙醇濃度和菊粉利用率達(dá)到最大值。通過(guò)Plackett-Burman（PB）篩選得到菊粉濃度、裝

7、液量和發(fā)酵時(shí)間為影響乙醇發(fā)酵和菊粉利用率的顯著因素，利用Central Composite Design（CCD）響應(yīng)面優(yōu)化，建立了菊粉利用率及乙醇濃度的多元二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)回歸模型，分析了模型的有效性與各因素間的交互作用，對(duì)回歸方程進(jìn)行尋優(yōu)得到了菊粉乙醇發(fā)酵中菊粉利用率的最佳工藝參數(shù)為：菊粉175.4g/L、裝液量102.5mL、發(fā)酵時(shí)間75.0h，在此條件下，菊粉利用率可達(dá)到92.2％；當(dāng)菊粉濃度、裝液量和發(fā)酵時(shí)間的值分別為175.1