REV囊膜糖蛋白env基因的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)前病毒全基因cDNA克隆質(zhì)粒DNA(pB101)為模板，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增出1200bp大小的env基因片段，并將其克隆到PGEX-4T-3表達(dá)載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了PGEX-4T-3-env表達(dá)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，env基因在大腸桿菌中以包涵體的形式進(jìn)行了高效表達(dá)。以尿素溶解液洗滌并溶解包涵體蛋白，4℃復(fù)性后用

2、GST融合蛋白純化試劑盒純化；將純化產(chǎn)物用牛凝血酶酶解切除GST標(biāo)簽蛋白便獲得了純env基因囊膜糖蛋白，用Western blot對(duì)該蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析結(jié)果表明，env基因表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，能夠很好的識(shí)別REV抗體。 用純化的env蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)抗REV抗體的間接ELISA(ienv-ELISA)。經(jīng)對(duì)ienv-ELISA的最佳工作條件測(cè)定結(jié)果表明，抗原最佳包被濃度為10mg/ml、血清的最佳稀釋度為1：5

3、00，二抗的最佳稀釋度為1：5000，最佳包被液為T(mén)B，最佳顯色時(shí)間為15min。經(jīng)重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的ienv-ELISA方法有良好的可重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)差均小于15％；與雞IBDV MDV NDV AIV等病毒陽(yáng)性抗體均無(wú)交叉反應(yīng)；與全病毒ELISA(REV-ELISA)和IFA準(zhǔn)確性符合率均超過(guò)90％。 用純化的env蛋白免疫Babl/c小鼠，用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)Babl/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0

4、骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)選擇性培養(yǎng)、有限稀釋法克隆化和純化的env蛋白進(jìn)行篩選，獲得了16株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(分別命名為：0.5-2E12、3-2A11、3-2B3、3-2F3、1-2E3、3D2、1-2D8、1-2E9、1-1A4、1-2B5、1-2B4、1-2C1、1-2C2、1-2D1、1-2D11、1-2H8)。Western blot分析表明，16株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體均能特異性的識(shí)別env蛋白；間接免疫熒光

5、試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)結(jié)果顯示，有6株(0.5-2E12、3-2B3、1.2E3、3D2、1-2D8、1-2H8)雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體能特異性的識(shí)別REV全病毒。將6株雜交瘤細(xì)胞注射Balb/c小鼠制備腹水，間接ELISA檢測(cè)其腹水的抗體效價(jià)均超過(guò)105；將腹水蛋白進(jìn)行濃縮、純化，測(cè)定其濃度為8mg/ml。 用純化單抗建立檢測(cè)REV的雙抗體夾心ELISA方法，通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行最佳工作條件優(yōu)化結(jié)果表明，單抗、多抗和二抗的最佳工作