IKK2dn轉(zhuǎn)染受者未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25-T細(xì)胞致耐受作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 通過重組腺病毒介導(dǎo)的IKK2dn基因轉(zhuǎn)染受者未成熟樹突狀細(xì)胞(immaturedendritic cells，imDC)，并以此誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25-T細(xì)胞，進(jìn)而研究CD4+CD25-T細(xì)胞對免疫反應(yīng)的影響，并分析細(xì)胞因子的變化。探討轉(zhuǎn)染IKK2dn基因的受者來源imDC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25-T細(xì)胞致免疫耐受的特性及機(jī)制，從而為應(yīng)用受者來源imDC誘導(dǎo)免疫耐受提供新的解決思路和方法。
　　 方法：

2、
　　 本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行：第一部分，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)Lewis大鼠(受者)來源的imDC，轉(zhuǎn)染IKK2dn基因維持其未成熟狀態(tài)，并以此誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25-T細(xì)胞；第二部分，分選、收集CD4+CD25-T細(xì)胞，通過體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction.MLR)，檢測CD4+CD25-T細(xì)胞在MLR中的致耐受作用。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：1、無菌提取大鼠(受者)雙側(cè)股骨、脛骨，獲得骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞

3、，體外應(yīng)用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞分化為imDC，并于第五天收集細(xì)胞；2、分別用構(gòu)建好的空載體腺病毒(Adv-0)、IKK2dn重組腺病毒載體(Adv-IKK2dn)轉(zhuǎn)染imDC，獲得Adv0-DC及IKK2dn-DC，采用Western bl

4、otting檢測轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)情況，后與供者大鼠(Brown Norway，BN)抗原肽共孵育；3、將獲得的轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負(fù)載供者抗原的imDC與受者T細(xì)胞共培養(yǎng)，并用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25-T細(xì)胞的產(chǎn)生情況；4、采用免疫磁珠陰性加陽性分離法分選獲得CD4+CD25-T細(xì)胞，體外進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)；5、實(shí)驗(yàn)共分為陰性對照組、陽性對照組、Adv0-CD4+T細(xì)胞組(Adv0-DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞)、IKK2dn-T細(xì)胞組(IK

5、K2dn-DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25-T細(xì)胞)。分別以供者大鼠以及第三方大鼠制備的絲裂霉素C滅活的脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，受者大鼠T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，通過MTT法觀察CD4+CD25-T細(xì)胞對異體抗原刺激所引起的受者T細(xì)胞增殖反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力。ELISA法檢測細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IL-2、IL-10、IFN-γ及TGF-β的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們成功培養(yǎng)獲得了高濃度、純度的imDC，每只大鼠股骨和脛骨骨髓分離后計(jì)

6、數(shù)，約獲得3.0×107單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞活力檢測>95％。成功培養(yǎng)的imDC呈疏松半懸浮生長，表面可見少許不規(guī)則的樹枝狀突起，體積較大，用透射電鏡觀察，細(xì)胞呈類圓形，胞漿豐富，細(xì)胞器多，細(xì)胞表面偶見少量突起，符合imDC超微結(jié)構(gòu)特征，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型：CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)陽性率較低，分別約為19.1±2.15％、17.0±1.60％和27.0±2.21％，與前期研究一致。培養(yǎng)第14天，CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)陽性

7、率明顯增加(56.0±3.40％和66.5±1.40％)，與第5天相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、在倒置熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染腺病毒載體后的細(xì)胞膜表面染有綠色熒光，呈明顯的不規(guī)則的毛刺樣突起。采用Western blotting檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染IKK2dn后可以檢測到分子量為87kDa的條帶，證實(shí)成功轉(zhuǎn)染imDC。初次MLR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染IKK2dn并負(fù)載供者抗原的受者imDC刺激受者T細(xì)胞增殖能力低下，與負(fù)

8、載供者抗原的未轉(zhuǎn)染imDC以及轉(zhuǎn)染空載體的imDC(Adv0-DC)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、受者Lewis大鼠骨髓源性imDC轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負(fù)載BN大鼠抗原后可以在體外刺激誘導(dǎo)Lewis大鼠T細(xì)胞分化產(chǎn)生CD4+CD25-T。細(xì)胞，轉(zhuǎn)染IKK2dn的imDC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞中低表達(dá)CD25(18.5±1.40％)，和對照組(72.2±3.30％)及Adv0-DC組相比(63.7±1.

9、80％)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、體外實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)染IKK2dn并負(fù)載供者抗原受者imDC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25-T細(xì)胞能夠抑制同種異體抗原刺激所引起的受者T細(xì)胞的增殖。當(dāng)CD4+CD25-T。細(xì)胞為高比例時(shí)(CD4+CD25-T/MLR)，不僅能夠抑制供者抗原刺激引起的T細(xì)胞增殖，而且抑制第三方抗原引起的T細(xì)胞增殖(P<0.05)；當(dāng)CD4+CD25-T細(xì)胞為低比例時(shí)，此種抑制作用具有抗原特異性，僅

10、對供者抗原引起的增殖反應(yīng)具有抑制作用(P<0.05)。MLR上清中IL-10、TGF-β水平明顯升高(P<0.05)，IL-2、IFN-γ水平明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、轉(zhuǎn)染IKK2dn基因并負(fù)載供者抗原的受者imDC可以誘導(dǎo)受者T細(xì)胞產(chǎn)生CD4+CD25-T細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)此種CD4+CD25-T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)受者T細(xì)胞特異性低反應(yīng)，具有誘導(dǎo)免疫耐受的作用。
　　 2、CD4+CD25-

11、T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制功能具有供者抗原特異性，此種特異性與CD4+CD25-T細(xì)胞所占比例有關(guān)，其作用機(jī)理與分泌高水平的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β，抑制T細(xì)胞向效應(yīng)性T細(xì)胞方向分化有關(guān)。
　　 3、體外應(yīng)用低劑量細(xì)胞因子IL-4(5ng/ml)和GM-CSF(5ng/ml)可以高效的誘導(dǎo)培養(yǎng)足夠數(shù)量及純度的未成熟樹突狀細(xì)胞，為DC誘導(dǎo)免疫耐受提供了可能。
　　 4、Adv-IKK2dn轉(zhuǎn)染受者imDC能夠維持其未成熟狀