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文檔簡介
1、黃曲霉毒素(AF)被劃定為I類致癌物,黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種主要的黃曲霉毒素,其污染物大大降低了食物的安全水平,對人類的健康有重大的威脅。黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代謝產(chǎn)物,奶牛攝入被AFB1污染的飼料,15min后可在血液中檢測到AFM1,8h后可在奶中檢測到AFM1。部分AFM1會隨乳汁、尿液排出,一部分則留在動物的可食用的組織和器官如血、腎、肝等。AFM1在乳汁中最為常見,這使得牛奶及其奶制品成為易受
2、AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障對AFM1攝取的機理,將有助于有效地減少奶牛乳腺上皮細胞對血液循環(huán)中AFM1的攝取,從而保證我國牛奶以及奶制品的質(zhì)量安全。
為了研究奶牛血乳屏障對AFM1的攝取方式以及轉(zhuǎn)運AFM1的分子機理,本實驗采用中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞進行原代培養(yǎng),細胞以1×106個/mL的密度接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上,在體外構(gòu)建了奶牛血乳屏障模型。在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障是由單一的乳腺上
3、皮細胞增殖而來。激光掃描共聚焦結(jié)果顯示,乳腺上皮細胞之間形成了較好的緊密連接,而且乳腺上皮細胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障模型可以成為體外研究藥物在血乳屏障中轉(zhuǎn)運機理的模型。
為了研究奶牛乳腺上皮細胞對AFM1的攝取方式,通過采用熒光定量PCR檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因m
4、RNA表達量的影響,結(jié)果顯示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表達量較高,有可能參與AFM1在血乳屏障中的轉(zhuǎn)運。同時,我們也采用Western blotting方法檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對ABCG2和ABCB1蛋白表達量的影響,結(jié)果顯示與不添加AFM1培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞相比,ABCG2和ABCB1蛋白表達量顯著提高(P<0.01),這種結(jié)果更大程度上表明ABCG2和ABCB1轉(zhuǎn)運蛋白參與AFM1轉(zhuǎn)運的可能性。
為了
5、進一步研究ABCG2對AFM1轉(zhuǎn)運作用的影響,試驗構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP對細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,從而進行ABCG2基因的過表達試驗研究;同時應用RNA干擾的方法用ABCG2 siRNA對細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,從而進行ABCG2基因的抑制試驗研究。再通過采用熒光定量PCR和Western blotting檢測在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表達量的影響,同時采用液
6、相色譜法對收集的細胞和Transwell上室的培養(yǎng)液中AFM1的含量進行檢測。熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示:ABCG2基因的過表達和抑制對ABCG2 mRNA和蛋白表達量均有極顯著性影響(P<0.01),而對β-酪蛋白的表達均無顯著性影響(P>0.05)。AFM1液相色譜結(jié)果顯示:ABCG2基因過表達上調(diào)細胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P<0.01),ABCG2基因抑制下調(diào)細胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含
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