重組人溶菌酶酵母工程菌的構(gòu)建和活性干粉制備.pdf

1、溶菌酶是一種能水解致病菌細(xì)胞壁的堿性蛋白質(zhì)，具有抗菌消炎和增強(qiáng)免疫力等功效，在臨床和食品保鮮方面具有較大應(yīng)用價(jià)值。已知的溶菌酶根據(jù)來(lái)源不同可分為三類:雞卵清溶菌酶（c型）、鵝卵清溶菌酶（g型）和噬菌體溶菌酶，其中人溶菌酶屬于c型，人溶菌酶編碼基因（hLYZ）全長(zhǎng)891 bp，可編碼148個(gè)氨基酸，成熟肽由130個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量大小約為14.7 kD。本實(shí)驗(yàn)從人胎盤(pán)組織中克隆了hLYZ基因，將其編碼區(qū)信號(hào)肽切除，成熟肽基因與畢

2、赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA連接，構(gòu)建重組分泌型表達(dá)載體pPICZαA-hLYZ，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)48h，從上清液收集蛋白，SDS-PAGE測(cè)得目的蛋白表達(dá)且表達(dá)量占上清液總蛋白的20.4％，溶壁微球菌抑菌試驗(yàn)測(cè)定抑菌圈直徑為1.423 cm，說(shuō)明重組酵母成功表達(dá)有活性的溶菌酶。為了研究載體信號(hào)肽對(duì)蛋白表達(dá)的影響，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將表達(dá)載體pPICZαA信號(hào)肽C端與hL YZ成熟蛋白質(zhì)N端相連的2個(gè)氨基酸Leu

3、和Glu分別突變成Pro和His，構(gòu)建了1個(gè)新的突變表達(dá)載體，隨后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，甲醇誘導(dǎo)72 h，野生型的相對(duì)表達(dá)量是31.2％，突變型的相對(duì)表達(dá)量是43.8％，約是野生型的表達(dá)量的1.4倍，且突變體的抑菌圈直徑為1.950 cm，也明顯大于野生型的抑菌圈直徑，說(shuō)明改造該載體可促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。
　　近年來(lái)，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)人溶菌酶的基因工程產(chǎn)品研究較多，而關(guān)

4、于酵母胞內(nèi)表達(dá)該酶卻鮮有報(bào)道。本研究旨在構(gòu)建一種胞內(nèi)表達(dá)溶菌酶的新型酵母工程菌，利用其高蛋白、分泌溶菌酶的特點(diǎn)開(kāi)發(fā)新型動(dòng)物飼料添加劑，避免直接使用人溶菌酶制劑帶來(lái)的高成本、活性不穩(wěn)定等問(wèn)題。研究方法是將自人胎盤(pán)提取的人溶菌酶編碼基因hLYZ克隆至表達(dá)載體pPICZA上，經(jīng)驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，接種BMGY培養(yǎng)基在30℃條件下220rpm搖床培養(yǎng)12h，換至BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h添加甲醇至終濃度為1％進(jìn)

5、行誘導(dǎo)表達(dá)，48 h后western blot測(cè)定蛋白表達(dá)且比濁法測(cè)定人溶菌酶活力為1920 U，SDS-PAGE未檢測(cè)到蛋白條帶，說(shuō)明目的蛋白胞內(nèi)表達(dá)量不高，可能是和酵母自身密碼子偏好有關(guān)，且酵母細(xì)胞壁含有溶菌酶的最適作用底物，也可能影響到溶菌酶的表達(dá)量。
　　實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)酵母所用培養(yǎng)基BMGY/BMMY成本較高，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為了尋求高效、廉價(jià)的培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)將酵母培養(yǎng)基進(jìn)行改良，已有報(bào)道利用豆粕玉米等培養(yǎng)酵母，但蛋

6、白利用率較低，本實(shí)驗(yàn)選用麥芽汁和蠶蛹粉，為酵母生長(zhǎng)提供所必需的碳源、氮源，酵母營(yíng)養(yǎng)鹽可以提供酵母生長(zhǎng)所必需的微量元素。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。單因素結(jié)果表明酵母培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為蠶蛹粉占比40％，酵母營(yíng)養(yǎng)鹽含量為170 ug/mL。利用麥芽汁-蠶蛹粉基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基/麥芽汁高溫浸提液培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細(xì)胞，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果R值的順序?yàn)?生長(zhǎng)階段pH＞誘導(dǎo)階段甲醇含量＞接種量;即最佳培養(yǎng)條件為生長(zhǎng)階段pH為6.0，誘導(dǎo)階段