吡咯喹啉醌高產(chǎn)菌的篩選、誘變、發(fā)酵及基因克隆.pdf

1、吡咯喹啉醌(PQQ)是一種新型的氧化還原型輔酶，具有許多生物功能，近幾年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。本論文主要致力于吡咯喹啉醌產(chǎn)量方面的研究，分為以下四個(gè)章節(jié)。
　　 1、本實(shí)驗(yàn)篩選獲得一株高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌株，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA鑒定屬于假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.0813，簡(jiǎn)稱(chēng):PS0813。用非酶檢測(cè)法和高效液相色譜檢測(cè)PS0813合成的PQQ能力，該菌種在未經(jīng)過(guò)任何優(yōu)化和基因工程改造下合成能力達(dá)到258

2、mg/L。
　　 2、由于其出色的產(chǎn)PQQ能力，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵以得到更高產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)。對(duì)PS0813的培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件進(jìn)行研究。優(yōu)化后依次對(duì)PS0813進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵補(bǔ)料采用流加碳氮源和無(wú)機(jī)鹽的方法，PQQ產(chǎn)量分別最高可達(dá)到448 mg/L和695 mg/L。這在未經(jīng)任何誘變或基因工程改造條件下的天然菌株中，居于最高產(chǎn)量。
　　 3、之后為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量對(duì)其進(jìn)行誘變育種。本

3、研究采用紫外-NaNO2復(fù)合誘變進(jìn)行篩選，分別研究紫外的致死率和正突變率以及NaNO2致死率和正突變率，最終誘變劑量為紫外照射30 S之后與0.1M的NaNO2反應(yīng)5min的條件下誘變效果最好，篩選出兩株高產(chǎn)誘變株P(guān)M1和PM2，經(jīng)傳代培養(yǎng)2代確定其具有遺傳穩(wěn)定性。對(duì)PM1和PM2進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)量分別比原代菌產(chǎn)量提高1.63倍和1.56倍。
　　 4、為了在基因水平上對(duì)PS0813菌株進(jìn)一步研究，對(duì)該菌株的PQQ合成基因簇進(jìn)行擴(kuò)增