褶紋冠蚌Kunitz型和SerpinB型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因克隆與表達.pdf

1、本文從褶紋冠蚌（Cristaria plicata）中克隆到了絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz基因和Serpin B基因的cDNA全長序列，并對其同源性和三級結(jié)構(gòu)進行了分析，采用定量PCR方法檢測這2個基因在褶紋冠蚌肝胰腺、血細胞、閉殼肌、鰓和外套膜組織中的相對表達量，利用PBS、革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和脂多糖（LPS）刺激誘導(dǎo)蚌后，檢測這2個基因在蚌的血細胞和肝胰腺組織中的表達變化。以質(zhì)粒p

2、et-32為載體用基因重組技術(shù)構(gòu)建pET32-Kunitz原核表達載體，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達并純化出純度較高的Kunitz的重組蛋白。
　　褶紋冠蚌絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz型基因的cDNA全長序列為1378 bp，其中5’UTR有128 bp；3’UTR有482 bp，含有一個poly A尾；開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)長度為768bp，編碼的蛋白質(zhì)含255個氨基酸。該蛋白序列N端有1個

3、信號肽序列，包含17個氨基酸結(jié)構(gòu)。成熟肽由238個氨基酸組成。該蛋白理論等電點（PI）為8.32，相對分子量為28.7 kDa。其序列與茅竹蟶（Solen grandis）高度相似，為98％。Kunitz型有4個保守序列，空間結(jié)構(gòu)含有6個β折疊和3個ɑ-螺旋。Kunitz型基因在血細胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測到了表達量，其中在外套膜的表達量是最低的，轉(zhuǎn)錄水平最高的組織是血細胞，其次是肝胰腺。嗜水氣單胞菌刺激后的實驗組褶紋冠蚌，

4、與PBS對照組相比，血細胞和肝胰臟的表達量都在12 h達到最大值，肝胰臟在48h左右恢復(fù)到0 h的表達水平，血細胞在48 h表達量仍然維持在較高水平。在脂多糖刺激組中，肝胰臟和血細胞的mRNA轉(zhuǎn)錄水平也是在12 h達到最高值，之后回落，但肝胰臟的增幅更明顯。通過質(zhì)粒pET-32與目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32-Kunitz在誘導(dǎo)破碎后發(fā)現(xiàn)其以可溶性蛋白主要存在于上清中。Kunitz的可溶性蛋白經(jīng)純化獲得了純度較高的重組pET32-Kun

5、itz，經(jīng)分析確認所得重組蛋白在40 kDa左右，與預(yù)測的蛋白大小一致。
　　褶紋冠蚌Serpin B cDNA全長為1565 bp，包括3’端非翻譯區(qū)362 bp，5’非編碼區(qū)（UTR）長21 bp，含有典型的腺苷酸信號序列AATAA和PolyA尾。該基因序列包含一個編碼393個氨基酸的開放閱讀框（ORF），編碼區(qū)1182 bp，預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子量為44.2 kDa，等電點為6.57。與牡蠣（Crassostrea gigas

6、）的同源性最高，為47%。在氨基酸25-391的位置為SERPIN結(jié)構(gòu)域，該蛋白為Serpins超家族蛋白。Serpin B型基因在血細胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測到了表達量，其在鰓中的轉(zhuǎn)錄水平最低，在血細胞中轉(zhuǎn)錄水平最高，約為鰓的9.92倍，其次是肝胰臟，約為鰓的6.85倍。嗜水氣單胞菌刺激褶紋冠蚌后，與PBS對照組相比，血細胞和肝胰臟的表達量都在6~24 h增長趨勢趨于緩和，在48 h達到最大，尤以肝胰臟表現(xiàn)敏感。在脂多糖刺