BTLA和ICOS早期預測腎移植術(shù)后急性排斥反應的臨床研究.pdf

1、腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經(jīng)濟的一種治療方法，以同種異體尸體腎移植為主，移植后易發(fā)生排斥反應。盡管隨著現(xiàn)代強效非特異性免疫抑制劑的發(fā)展和臨床應用，同種異體器官移植取得了長足的進步，急性排斥反應發(fā)生率明顯減少，但急性排斥反應臨床表現(xiàn)也越來越不典型，往往需要移植腎病理學檢查。雖然病理學檢查是臨床診斷的金標準，但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導致各種并發(fā)癥。因此，尋找經(jīng)濟方便、無創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的檢測指標對預測急性排斥

2、反應的發(fā)生和提高移植腎的存活率十分重要。
　　 器官移植排斥反應主要是激活了受體體內(nèi)的細胞免疫機制，即受體免疫系統(tǒng)識別異體抗原引起效應T細胞激活和釋放一系列效應分子攻擊和排斥異體移植器官。T細胞在移植排斥反應中起核心作用。T細胞活化、克隆增殖和產(chǎn)生細胞因子需要兩種信號參與：第一信號是由T細胞受體(TCR)與抗原呈遞細胞(APC)表面的MHC抗原復合物相互作用產(chǎn)生；第二信號為共刺激信號，由可溶性共刺激分子或APC表面的分子配體提供

3、。
　　 B、T淋巴細胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白表面分子家族成員，其與細胞毒T淋巴細胞抗原-4(CTIA-4)、程序壞死因子-1(PD-1)構(gòu)成了一組抑制性受體，主要在T、B淋巴細胞上表達。BTLA與其配體結(jié)合后，對活化的T細胞可產(chǎn)生抑制效應，從而防止過強的細胞免疫應答，維持免疫耐受，保護機體免受自身免疫反應的損傷。皰疹病毒進入介質(zhì)(Herpes Vi

4、rus Entry Mediator，HVEM)是BTLA的特異性配體，二者結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同抑制信號；而HVEM與腫瘤壞死因子超家族成員LIGHT結(jié)合則產(chǎn)生協(xié)同刺激信號。可誘導共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)是T細胞膜表面的共刺激因子，其配體ICOSL，亦稱為GL-50、B7相關蛋白-1(B7RP-1)或B7同源蛋白(B7h)，參與T細胞效應階段的調(diào)節(jié)，對T、B淋巴細胞的增殖與活化、各種細胞因子的產(chǎn)生與分

5、泌起重要作用。ICOS/ICOSL共刺激通路阻斷后伴有多種細胞因子和趨化因子的下調(diào)。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在明確腎移植患者以臨床常規(guī)使用的免疫抑制劑三聯(lián)治療措施預防急性排斥反應過程中，BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL在外周血淋巴細胞表達及血清相關細胞因子的變化。評價BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL對腎移植急性排斥反應發(fā)生的早期預測作用，為臨床早期診斷提供新的無創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的急性

6、排斥反應預測指標，以便預防和及時治療腎移植急性排斥反應，提高患者移植腎的存活率，改善腎移植患者的生存率和生活質(zhì)量。
　　 研究方法:
　　 1.標本采集：選取自我院2008年2月至2011年2月終末期腎病患者行腎移植手術(shù)281例，尸體供腎，熱缺血時間<8min、冷缺血時間<10小時，腎移植術(shù)后應用MMF+CSA+Pred或MMF+FK506+Pred三聯(lián)藥物治療，排除應用賽尼哌、OKT3、ALG等單克隆抗體、多克隆抗體的

7、患者，以排除對監(jiān)測指標的影響；排除發(fā)生術(shù)后感染、手術(shù)等并發(fā)癥；排除發(fā)生移植腎功能延期恢復者。根據(jù)Banff2005標準診斷急性排斥反應并進行分組，分為移植腎功能穩(wěn)定組和腎移植急性排斥組。入組的急性排斥患者必須滿足發(fā)生AR時間為10±2天，并且應用MP沖擊治療3天(MP500mg/d)效果顯著，排斥得到逆轉(zhuǎn)這一條件，不符合者剔除。隨機選取20例移植腎功能穩(wěn)定患者、20例發(fā)生急性排斥反應患者。觀察40例病人一般情況，尿量、腎功能、血藥濃度、

8、T細胞亞群等，于手術(shù)當日(術(shù)前)及術(shù)后第3、7、14、28天采集外周血分離淋巴細胞和血清進行實驗。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核同意。
　　 2.RT-PCR、實時熒光定量PCR檢測外周血淋巴細胞中BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL mRNA表達水平。采用TRIZOL法提取RNA，由公司合成PrimerPrimier5設計的引物序列，進行常規(guī)PCR反應。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并讀

9、取、分析像素值。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL的表達水平。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的濃度。取腎移植術(shù)前及術(shù)后3、7、14、28天的外周血，分離血清-80℃保存。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的含量的檢測嚴格按照ELIS

10、A試劑盒說明書進行操作，并用酶標儀在450nm波長測量0.D。值。
　　 5.SPSS12統(tǒng)計軟件、Graphpad Prism5.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，比較術(shù)后不同時間、不同組別之間共刺激分子或共抑制分子及細胞因子表達水平差異，并分析與腎移植急性排斥反應發(fā)生的相關性。計量資料采用均數(shù)±標準差(x±S)表示，采用兩個獨立樣本t檢驗比較CR組和正常組的均數(shù)，數(shù)據(jù)間比較應用方差分析，技術(shù)資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意

11、義。
　　 結(jié)果:
　　 1.兩組病人一般臨床特征，包括性別、年齡、熱缺血時間、冷缺血時間及術(shù)后免疫抑制劑方案等方面，兩組間比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 2.外周血淋巴細胞BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL表達水平：RT-PCR、q-PCR和流式細胞術(shù)結(jié)果一致顯示，移植后第3天各分子相對表達量較移植前明顯升高，第7、14、28天各分子相對表達量逐漸下降。而腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應的患者BTL

12、A、HVEM、ICOS、ICOSL表達水平與腎功能穩(wěn)定組相比都有顯著升高，以術(shù)后第7～14天：BTLA、ICOS升高最為顯著(P<0.01)。
　　 3.外周血淋巴細胞IL-2、IFN-γ、IL.10、IL-4 mRNA表達水平：移植后第3天各分子相對表達量較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子相對表達量逐漸下降，腎移植術(shù)后急性排斥組IL-2、IFN-γ表達水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植

13、排斥反應出現(xiàn)的時間密切相關。
　　 4.血清IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4濃度：移植后第3天各分子血清濃度較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子血清濃度逐漸下降，腎移植術(shù)后急性排斥組IL-2、IFN-℃表達水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植排斥反應出現(xiàn)的時間密切相關。
　　 5.分析BTLA、ICOS表達與急性排斥反應發(fā)生的相關性：BTLA、ICOS及細胞因子IL-2和I

14、FN-γ均較臨床指標(BUN、Cr)能夠提前判斷是否發(fā)生急性排斥反應。外周血淋巴細胞上的BTLA、ICOS與臨床指標比較P<0.01，細胞因子IL-2和IFN-γ與臨床指標比較P<0.05，說明這幾項指標與臨床診斷指標相比具有顯著的統(tǒng)計學差異，可以比臨床現(xiàn)有診斷指標提前預知腎移植患者移植后是否發(fā)生急性排斥反應。
　　 6.將各指標聯(lián)合，觀察聯(lián)合指標與臨床確診的符合情況：判斷各組合指標的靈敏度都比較好，從單個指標來看，IL-2的效

15、果最好，其靈敏度和特異度都比較高，其Youden指數(shù)達到0.8500，尤其是在檢測了IL-2這個指標之后，在任意添加其他一個指標或多個指標，其靈敏度都達到100％。在BTLA、IFN-γ及組合BTLA+IFN-γ、ICOS+IFN-γ這幾個指標的靈敏度都比較高，但是特異度較低，容易造成假陽性結(jié)果。BTLA和ICOS作為單個指標，其靈敏度和特異度都比較高，二者聯(lián)合之后的靈敏度和特異度也比較高。
　　 結(jié)論:
　　 本研究通

16、過RT-PCR、q-PCR及流式細胞術(shù)等方法檢測了腎移植患者術(shù)前與術(shù)后不同時間段外周血淋巴細胞中BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL的表達水平，以及相關細胞因子在外周血淋巴細胞的基因表達和血清濃度變化。結(jié)果顯示，術(shù)前BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL均表達不明顯，術(shù)后第3天均表達明顯增加，用藥后第7、14、28天表達水平逐漸下降；器官移植急性排斥反應常發(fā)生于術(shù)后5天～3月，細胞因子的變化可以作為排斥反應發(fā)生的指標之一。本研究證