BTLA和ICOS早期預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的臨床研究.pdf

1、腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經(jīng)濟(jì)的一種治療方法，以同種異體尸體腎移植為主，移植后易發(fā)生排斥反應(yīng)。盡管隨著現(xiàn)代強(qiáng)效非特異性免疫抑制劑的發(fā)展和臨床應(yīng)用，同種異體器官移植取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯減少，但急性排斥反應(yīng)臨床表現(xiàn)也越來(lái)越不典型，往往需要移植腎病理學(xué)檢查。雖然病理學(xué)檢查是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導(dǎo)致各種并發(fā)癥。因此，尋找經(jīng)濟(jì)方便、無(wú)創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)急性排斥

2、反應(yīng)的發(fā)生和提高移植腎的存活率十分重要。
　　 器官移植排斥反應(yīng)主要是激活了受體體內(nèi)的細(xì)胞免疫機(jī)制，即受體免疫系統(tǒng)識(shí)別異體抗原引起效應(yīng)T細(xì)胞激活和釋放一系列效應(yīng)分子攻擊和排斥異體移植器官。T細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)中起核心作用。T細(xì)胞活化、克隆增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子需要兩種信號(hào)參與：第一信號(hào)是由T細(xì)胞受體(TCR)與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的MHC抗原復(fù)合物相互作用產(chǎn)生；第二信號(hào)為共刺激信號(hào)，由可溶性共刺激分子或APC表面的分子配體提供

3、。
　　 B、T淋巴細(xì)胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白表面分子家族成員，其與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原-4(CTIA-4)、程序壞死因子-1(PD-1)構(gòu)成了一組抑制性受體，主要在T、B淋巴細(xì)胞上表達(dá)。BTLA與其配體結(jié)合后，對(duì)活化的T細(xì)胞可產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而防止過(guò)強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，維持免疫耐受，保護(hù)機(jī)體免受自身免疫反應(yīng)的損傷。皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(Herpes Vi

4、rus Entry Mediator，HVEM)是BTLA的特異性配體，二者結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同抑制信號(hào)；而HVEM與腫瘤壞死因子超家族成員LIGHT結(jié)合則產(chǎn)生協(xié)同刺激信號(hào)。可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)是T細(xì)胞膜表面的共刺激因子，其配體ICOSL，亦稱為GL-50、B7相關(guān)蛋白-1(B7RP-1)或B7同源蛋白(B7h)，參與T細(xì)胞效應(yīng)階段的調(diào)節(jié)，對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的增殖與活化、各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生與分

5、泌起重要作用。ICOS/ICOSL共刺激通路阻斷后伴有多種細(xì)胞因子和趨化因子的下調(diào)。
　　 研究目的:
　　 本研究旨在明確腎移植患者以臨床常規(guī)使用的免疫抑制劑三聯(lián)治療措施預(yù)防急性排斥反應(yīng)過(guò)程中，BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL在外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)及血清相關(guān)細(xì)胞因子的變化。評(píng)價(jià)BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL對(duì)腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生的早期預(yù)測(cè)作用，為臨床早期診斷提供新的無(wú)創(chuàng)傷、具有高度敏感性和特異性的急性

6、排斥反應(yīng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，以便預(yù)防和及時(shí)治療腎移植急性排斥反應(yīng)，提高患者移植腎的存活率，改善腎移植患者的生存率和生活質(zhì)量。
　　 研究方法:
　　 1.標(biāo)本采集：選取自我院2008年2月至2011年2月終末期腎病患者行腎移植手術(shù)281例，尸體供腎，熱缺血時(shí)間<8min、冷缺血時(shí)間<10小時(shí)，腎移植術(shù)后應(yīng)用MMF+CSA+Pred或MMF+FK506+Pred三聯(lián)藥物治療，排除應(yīng)用賽尼哌、OKT3、ALG等單克隆抗體、多克隆抗體的

7、患者，以排除對(duì)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的影響；排除發(fā)生術(shù)后感染、手術(shù)等并發(fā)癥；排除發(fā)生移植腎功能延期恢復(fù)者。根據(jù)Banff2005標(biāo)準(zhǔn)診斷急性排斥反應(yīng)并進(jìn)行分組，分為移植腎功能穩(wěn)定組和腎移植急性排斥組。入組的急性排斥患者必須滿足發(fā)生AR時(shí)間為10±2天，并且應(yīng)用MP沖擊治療3天(MP500mg/d)效果顯著，排斥得到逆轉(zhuǎn)這一條件，不符合者剔除。隨機(jī)選取20例移植腎功能穩(wěn)定患者、20例發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者。觀察40例病人一般情況，尿量、腎功能、血藥濃度、

8、T細(xì)胞亞群等，于手術(shù)當(dāng)日(術(shù)前)及術(shù)后第3、7、14、28天采集外周血分離淋巴細(xì)胞和血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。
　　 2.RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞中BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL mRNA表達(dá)水平。采用TRIZOL法提取RNA，由公司合成PrimerPrimier5設(shè)計(jì)的引物序列，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并讀

9、取、分析像素值。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL的表達(dá)水平。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的濃度。取腎移植術(shù)前及術(shù)后3、7、14、28天的外周血，分離血清-80℃保存。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的含量的檢測(cè)嚴(yán)格按照ELIS

10、A試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量0.D。值。
　　 5.SPSS12統(tǒng)計(jì)軟件、Graphpad Prism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，比較術(shù)后不同時(shí)間、不同組別之間共刺激分子或共抑制分子及細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，并分析與腎移植急性排斥反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較CR組和正常組的均數(shù)，數(shù)據(jù)間比較應(yīng)用方差分析，技術(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義。
　　 結(jié)果:
　　 1.兩組病人一般臨床特征，包括性別、年齡、熱缺血時(shí)間、冷缺血時(shí)間及術(shù)后免疫抑制劑方案等方面，兩組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2.外周血淋巴細(xì)胞BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL表達(dá)水平：RT-PCR、q-PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致顯示，移植后第3天各分子相對(duì)表達(dá)量較移植前明顯升高，第7、14、28天各分子相對(duì)表達(dá)量逐漸下降。而腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者BTL

12、A、HVEM、ICOS、ICOSL表達(dá)水平與腎功能穩(wěn)定組相比都有顯著升高，以術(shù)后第7～14天：BTLA、ICOS升高最為顯著(P<0.01)。
　　 3.外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ、IL.10、IL-4 mRNA表達(dá)水平：移植后第3天各分子相對(duì)表達(dá)量較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，腎移植術(shù)后急性排斥組IL-2、IFN-γ表達(dá)水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植

13、排斥反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間密切相關(guān)。
　　 4.血清IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4濃度：移植后第3天各分子血清濃度較移植前明顯升高，腎功能穩(wěn)定組用藥后第7、14、28天各分子血清濃度逐漸下降，腎移植術(shù)后急性排斥組IL-2、IFN-℃表達(dá)水平在第14天出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，與移植排斥反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間密切相關(guān)。
　　 5.分析BTLA、ICOS表達(dá)與急性排斥反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性：BTLA、ICOS及細(xì)胞因子IL-2和I

14、FN-γ均較臨床指標(biāo)(BUN、Cr)能夠提前判斷是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)。外周血淋巴細(xì)胞上的BTLA、ICOS與臨床指標(biāo)比較P<0.01，細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ與臨床指標(biāo)比較P<0.05，說(shuō)明這幾項(xiàng)指標(biāo)與臨床診斷指標(biāo)相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以比臨床現(xiàn)有診斷指標(biāo)提前預(yù)知腎移植患者移植后是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)。
　　 6.將各指標(biāo)聯(lián)合，觀察聯(lián)合指標(biāo)與臨床確診的符合情況：判斷各組合指標(biāo)的靈敏度都比較好，從單個(gè)指標(biāo)來(lái)看，IL-2的效

15、果最好，其靈敏度和特異度都比較高，其Youden指數(shù)達(dá)到0.8500，尤其是在檢測(cè)了IL-2這個(gè)指標(biāo)之后，在任意添加其他一個(gè)指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)，其靈敏度都達(dá)到100％。在BTLA、IFN-γ及組合BTLA+IFN-γ、ICOS+IFN-γ這幾個(gè)指標(biāo)的靈敏度都比較高，但是特異度較低，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。BTLA和ICOS作為單個(gè)指標(biāo)，其靈敏度和特異度都比較高，二者聯(lián)合之后的靈敏度和特異度也比較高。
　　 結(jié)論:
　　 本研究通

16、過(guò)RT-PCR、q-PCR及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)了腎移植患者術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間段外周血淋巴細(xì)胞中BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL的表達(dá)水平，以及相關(guān)細(xì)胞因子在外周血淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)和血清濃度變化。結(jié)果顯示，術(shù)前BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL均表達(dá)不明顯，術(shù)后第3天均表達(dá)明顯增加，用藥后第7、14、28天表達(dá)水平逐漸下降；器官移植急性排斥反應(yīng)常發(fā)生于術(shù)后5天～3月，細(xì)胞因子的變化可以作為排斥反應(yīng)發(fā)生的指標(biāo)之一。本研究證