腎移植急性排斥反應相關蛋白的鑒定及應用評價.pdf

1、目的聯合運用Tricine-SDS-PAGE電泳、SELDI質譜技術和Western-blot技術，鑒定腎移植術后發(fā)生急性排斥反應患者血清中的高表達蛋白，尋找能為腎移植急性排斥反應的臨床早期診斷與治療提供可靠的、靈敏的實驗室參考指標。
　　 方法利用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(surface-enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectromet

2、ry，SELDI-TOF-MS)技術研究腎移植急性排斥組、穩(wěn)定存活組以及疾病對照組血清中蛋白質組學的改變，發(fā)現一系列急性排斥反應的相關蛋白。這些蛋白中質荷比(mass charge ratio，M/Z)為11731和9285的兩個蛋白血清中含量較高。挑選M/Z11731蛋白含量高的標本作為研究對象。利用Tricine-SDS-PAGE電泳技術分離純化蛋白、胰蛋白酶進行膠內酶解、SELDI-TOF-MS技術分析蛋白消化產物、獲得蛋白的肽指

3、紋圖譜(peptides mass fingerprinting，PMF)，在Profound蛋白數據庫內進行比對。利用免疫印跡法(Western-blot)對鑒定出的蛋白進行進一步確認。進一步檢測41份未經SELDI-TOF-MS技術分析的急性排斥反應和穩(wěn)定存活組的血清標本，觀察兩組之間該蛋白是否存在顯著差異性。并利用ROC曲線分析該蛋白鑒別急性排斥反應的診斷價值。
　　 結果經SELDI-TOF-MS技術獲得PMF，所包含肽

4、段M/Z分別為：1043.93、1068.52、1079.05、1095.20、1157.53、1293.60、1538.60、1717.94、1843.18、2614.44、2893.64、3004.98、3021.00、3149.33、3371.73、3395.91、3838.97、4539.083。在Profound蛋白數據庫內初步檢索得該蛋白為免疫球蛋白超家族的一員，Western-blot確認其為β2-MG。檢測顯示急性排斥反

5、應組標本血清中β2-MG濃度明顯高于穩(wěn)定存活組，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。當β2-MG含量大于3.545 mg/L時，判斷其為急性排斥反應的敏感性和特異性分別達到90％和90.5％。腎移植術后急性排斥反應患者血清β2-MG增高明顯早于血清肌酐增高，也明顯早于臨床表現。
　　 結論聯合SELDI-TOF-MS技術平臺和western-blot鑒定出M/Z11731蛋白為已知的β2-MG。實驗證明兩種技術結合鑒定未知蛋白