腎移植急性排斥反應(yīng)尿液中早期標(biāo)志物研究.pdf

1、急性排斥反應(yīng)(acute rejection，AR)是影響移植腎長期存活的一個關(guān)鍵因素。也是引起早期移植物損害和長期的移植物功能障礙以及慢性移植物腎病的主要原因，而目前通常診斷腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)方法包括：1.病人臨床體征，2.血肌酐、尿素氮等非特異性生化指標(biāo)檢查，3.移植腎影像學(xué)檢查，4.移植腎穿刺病理活檢。前3項檢查指標(biāo)只有當(dāng)移植腎功能發(fā)生明顯損傷后才能出現(xiàn)改變，并且這些改變都是非特異性的。組織活檢雖然是確診急性排斥反應(yīng)的“金

2、標(biāo)準(zhǔn)”，但穿刺活檢可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，而由于活檢取材部位的限制，并不能及時、全面的反應(yīng)出移植腎的損傷情況。因此，目前臨床急需篩選具有前瞻性、非侵入性和特異性的早期診斷AR的方法，以指導(dǎo)臨床用藥，提高移植腎的長期存活率 尿液可以及時準(zhǔn)確地反映整個腎臟的生理狀態(tài)和功能水平，而且收集簡單方便、是非侵入性診斷腎臟疾病的理想標(biāo)本。器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生是一種復(fù)雜的、動態(tài)的、多因素的病理過程，很難用傳統(tǒng)單一的指標(biāo)來準(zhǔn)確反映。而蛋白質(zhì)組是動

3、態(tài)的，有它的時空性，能夠在生命有機(jī)體整體水平上闡明生命現(xiàn)像的本質(zhì)和活動規(guī)律。因此本課題以腎移植術(shù)后發(fā)生AR前、中、后各期的尿液作為研究對象，應(yīng)用二維凝膠電泳—質(zhì)譜技術(shù)(2-DE-MS)及Westernblot技術(shù)等，以期找到一組具有前瞻性和特異性的蛋白分子作為早期診斷的候選標(biāo)志物。 首先，我們根據(jù)尿蛋白的含鹽高的特點(diǎn)優(yōu)化了2-DE過程中等電聚焦程序，與Bio-rad操作手冊推薦的等電聚焦方法相比，獲得的尿液2-DE圖譜點(diǎn)數(shù)由47

4、6個增加到564個。為充分去除尿液中的鹽分，我們建立了尿蛋白丙酮沉淀三步法處理樣品，結(jié)果顯示尿蛋白丙酮沉淀三步法處理得到的樣本在上述優(yōu)化的等電聚焦條件下所獲得的分離蛋白點(diǎn)更加清晰且圓，水平條帶更少。說明本次研究建立的2-DE技術(shù)平臺適用于尿蛋白研究。 然后，為了消除尿蛋白樣品的個體差異，本研究采取的是移植排斥反應(yīng)前后患者自身樣品的比較，即：排斥前3天相對光密度值與排斥后21天相對光密度值相比，選擇表達(dá)量變化大于3倍(P<0.05

5、)，并根據(jù)兩個體取6個時相點(diǎn)即：-3/-2/--1/7/14/21天相對光密度值做趨勢分析，應(yīng)同時具有明顯下降趨勢的30個蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。經(jīng)MADIL-TOF-MS/MS成功鑒定出其中的16個蛋白，經(jīng)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)、生物信息學(xué)和蛋白功能檢索，從中篩選了與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的3個蛋白，分別為α-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin，AACT)，鋅-α2糖蛋白(Zn-Alpha-2-Glycoprotein，ZAP)和

6、腫瘤排斥抗原gp96(tumor rejection antigen gp96，gp96)，進(jìn)行進(jìn)一步臨床樣本免疫印記驗證。 對腎移植術(shù)后發(fā)生AR患者臨床確診排斥前3～5天(n=8)和未發(fā)生AR患者術(shù)后7天(n=10)尿液蛋白進(jìn)行Westrenblot驗證發(fā)現(xiàn)：以肉眼觀察印記條帶出現(xiàn)有無為判斷標(biāo)準(zhǔn)，三個蛋白判定的準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別為：AACT，77.78％/100％/60％；ZAG，77.78％/100％/60％； gp

7、96，83.33％/87.5％/80％。將三個蛋白各組的測定值與同組對照的比值，運(yùn)用LING08.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，得到三個蛋白的判斷理論臨界值[0.15，0.35，0.50]，以此界值作為判別標(biāo)準(zhǔn)時，單一的ZAG可以將準(zhǔn)確率、敏感性和特異性提高到100％/100％/100％，AACT準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別達(dá)到94.4％/100％/90.00％； gp96準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別達(dá)到88.9％/100％/90.00％。最后應(yīng)用