菲律賓蛤仔酶解寡肽抗氧化活性研究.pdf

1、氧化反應在許多生物體中是一種重要的生物進程,自由基作為氧化反應的產(chǎn)物,非常不穩(wěn)定,可能導致DNA或蛋白質損傷,進而引發(fā)多種疾病,包括癌癥,阿爾茲海默氏癥以及其他神經(jīng)性疾病。盡管合成的抗氧化物具有良好的抗氧化活性,但因其潛在的毒性和副作用,消費者對這些抗氧化物的抵抗越來越強,因此,從自然資源中開發(fā)抗氧化物成為新的研究熱點。
　　本實驗采用酶解法制備菲律賓蛤仔酶解肽,酶解工藝通過正交試驗方案進行優(yōu)化,以最佳酶解條件制備酶解粗提物,粗提

2、物經(jīng)過分離純化,氨基酸序列分析,結構表征分析等得到酶解寡肽純化物;從體外和小鼠體內實驗兩方面對菲律賓蛤仔酶解寡肽的抗氧化活性進行研究。具體有如下幾個部分。
　　第一部分,菲律賓蛤仔酶解寡肽的制備。
　　首先將菲律賓蛤仔肌肉組織勻漿,利用胰蛋白酶酶解,采用正交實驗設計,以DPPH清除力為指標,對活性肽的酶解制備工藝進行優(yōu)化,得出最佳酶解條件為物料比1:2,加酶量2000U/g,pH為8,酶解溫度為40℃,酶解時間12h。在此酶

3、解條件下制備酶解物,利用超濾法將酶解物按分子量大小分成四個組分,收集抗氧化活性最強組分,濃縮后冷凍干燥,干燥物經(jīng)G-25凝膠分離得到六個洗脫峰,收集抗氧化活性最高的峰,濃縮、冷凍干燥后經(jīng)反相高效液相梯度洗脫進一步分離得到三個洗脫峰,選取最強抗氧化活性組分收集,高效液相檢測得出該提取物為單一組分,氨基酸序列分析得其序列為Gly-Asp-Gln-Gln-Lys,分子量為575.45Da。
　　第二部分,體外研究菲律賓蛤仔酶解寡肽抗氧化

4、活性。
　　1、采用分光光度法測定寡肽對2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基、超氧陰離子(O2-·)、羥自由基(·OH)、DPPH自由基的清除能力,還原力和寡肽的金屬離子螯合能力,結果發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔酶解寡肽具有較顯著的ABTS自由基(半數(shù)有效濃度(EC50)0.204 g.L-1)、羥自由基(EC500.815 g.L-1)、超氧陰離子自由基(EC500.066 g.L-1)清除能力、

5、還原力和金屬離子螯合能力(EC501.554 g.L-1)。
　　2、瓊脂糖凝膠電泳檢測寡肽對羥自由基誘導的DNA損傷的保護作用。結果顯示,與空白組(Blank)相比,對照組(Control)中超螺旋結構的DNA幾乎完全消失并轉化為開環(huán)結構,而加樣組(1.25 mg/mL,2.5 mg/mL和5 mg/mL)大部分DNA仍以超螺旋結構存在,小部分DNA被損傷形成開環(huán)結構DNA。說明寡肽對羥自由基誘導的DNA損傷顯示出有效地保護作用

6、,并且保護作用隨濃度的升高而增強。
　　3、四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測寡肽對腫瘤細胞DU-145和人體正常前列腺細胞RWPE-1的增殖抑制效應,結果發(fā)現(xiàn),寡肽對前列腺癌DU-145細胞具有明顯的增殖抑制作用(IC505.202mg/mL),并呈良好的量效關系。且人體正常前列腺細胞RWPE-1細胞毒性檢測結果表明,寡肽對RWPE-1細胞無增殖抑制作用。
　　第三部分,菲律賓蛤仔酶解寡肽體內抗氧化活性研究。
　　ICR

7、雄性小鼠隨機分成四組,分別灌服高、中、低劑量寡肽和生理鹽水。連續(xù)給藥30d后,心臟采血及組織取樣,用試劑盒測定小鼠血清、腦、肝臟組織中超氧化歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。結果顯示,菲律賓蛤仔酶解寡肽可有效提高小鼠體內SOD和GSH-Px活力,并降低MDA含量,表明寡肽具有小