轉(zhuǎn)Bt基因稻米加工品的LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、近年來(lái)，由于轉(zhuǎn)基因食品的安全性問(wèn)題，歐盟、美國(guó)、日本及我國(guó)等許多國(guó)家都相繼制定了轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品采取標(biāo)簽管理和溯源管理制度。2012年，中國(guó)出口到歐盟的米制品，由于被檢出含有轉(zhuǎn)基因成分，頻頻遭到審查和公告撤架。因此，為保護(hù)我國(guó)的貿(mào)易出口，迫切需要建立一種準(zhǔn)確、特異、快速的轉(zhuǎn)基因米制品檢測(cè)方法。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一

2、種新穎恒溫核酸擴(kuò)增方法，與傳統(tǒng)PCR方法相比，具有靈敏度高、特異性好、簡(jiǎn)單快速、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。目前這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因玉米和大豆以及轉(zhuǎn)基因飼料的分子檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，而在轉(zhuǎn)基因稻米檢測(cè)中的研究很少。
　　 本研究針對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻的外源Cry1Ac基因(GeneBank accession numberY09787)，利用LAMP技術(shù)，用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并對(duì)鎂離子濃度、Bst DNA聚合酶濃度、反應(yīng)

3、溫度、反應(yīng)時(shí)間等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了LAMP反應(yīng)體系。
　　 建立的LAMP反應(yīng)體系如下（25μL體系）:F3和B3（LAMP反應(yīng)外引物）各0.1μM，F(xiàn)IP和BIP（LAMP反應(yīng)內(nèi)引物）各1.28μM，3 mM MgCl2，2.8 mM dNTP，5 M betaine，6.4 U Bst DNA聚合酶大片段，2.5μL Bst DNA聚合酶緩沖液(20 mMTris-HCl(pH8.8,25C),10 mM KCl,10

4、 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4,0.1％TritonX-100)，100 ng DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:61℃保存1h，80℃滅活10 min。LAMP反應(yīng)結(jié)果可以將產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上觀察，如果產(chǎn)生階梯型條帶則說(shuō)明有擴(kuò)增發(fā)生。也可以直接向產(chǎn)物中加入熒光染料1000× SybrGreenⅠ混勻后觀察顏色變化，如果溶液由桔黃色變?yōu)榫G色則為陽(yáng)性，否則為陰性。
　　 此外，對(duì)LAMP引物的特異性

5、分別進(jìn)行了LAMP反應(yīng)和PCR反應(yīng)驗(yàn)證，結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因水稻結(jié)果為陽(yáng)性，其他樣品均為陰性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果也與此相符。建立的LAMP方法的實(shí)物檢測(cè)限為0.005％，陽(yáng)性質(zhì)粒檢測(cè)限為10拷貝，靈敏度比普通PCR高10倍。
　　 食品在加工過(guò)程中由于高溫、高壓、酸堿、發(fā)酵和剪切力等物理、化學(xué)因素的影響，DNA容易發(fā)生降解，這使得轉(zhuǎn)基因作物加工品的檢測(cè)具有一定難度。本研究用建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)稻米加工品——米飯和米酒