轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉種子PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉種子PCR檢測技術(shù)研究姓名：王子峰申請學位級別：碩士專業(yè)：作物遺傳育種指導教師：張春慶2003.6.9山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文轉(zhuǎn)B t 基因抗蟲棉種子P C R 檢測技術(shù)研究摘 要本研究以當前生產(chǎn)上廣泛使用的9 個棉花品種為試材，在D N A 快速提取方法、P C R 反應體系、特異引物篩選三個方面進行了研究，為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子快速檢測提供了依據(jù)。通過研究，得到如下結(jié)果： ＼( 1 ) 建立了可用

2、于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉檢測的D N A 快速提取方法：①將種子去皮、砸碎，加入l O 倍( u l ／m g ) 預熱( 7 0 。C ) 提取緩沖液( 1 0 0 m M T r i s - H C L ，P H ：8 ．4 ，1 ．5 ％S D S ) 。②7 0 。C 水浴提取l O m i n ，取出后立即加入等體積的酚一氯仿，8 0 0 0 r p m 離心i 0 分鐘。③取上清液l u l ，用作P C R 反應的模板。( 2 )

3、建立了適用于D N A 粗提液的相應P C R 反應體系：循環(huán)參數(shù)為：9 4 。C 預變性2 m i n ， 9 4 。C 變性4 0 s ，適當溫度退火4 0 s ，7 2 | 。C 延伸5 0 s ，3 0 個循環(huán)，7 2 。C 延伸5 m i n 。反應體系：2 ．5 u l1 0 ×B u f f e r ，1 ．5 u lM 9 2 +( 2 5 I I I M ) ，l u ld N T P ( 2 ．5 m M

4、) ，0 ．2 u lT a q E ( 5 U ) ，0 ．5 u lP r i m e r ( 2 0 p m 0 1 ) ，l u l D N A 約6 0 n g ，H 2 01 7 ．8 u l ，共2 5 u l 。( 3 ) 篩選出四對可用于轉(zhuǎn)B t 基因棉檢測的特異性引物：①3 5 S 區(qū)引物：P r i m e r l 5 ’一C C A T C A T T G C G A T A A A G G A A A 一3 ’

5、P r i m e r 2 5 ’一G T C T T G C G A A G G A T A G T G G G 一3 ’②3 5 S 區(qū)( P r i m e r 3 ) 與B t 目的基因區(qū)( P r i m e r 4 ) 引物：P r i m e r 3 5 ’一C A T C A T T G C G A T A A A G G 一3 ’P r i m e r 4 5 ’- - C T A G A G A T G G C C