沙門菌屬stn基因LAMP快速檢測方法的研究.pdf

1、沙門菌是對人類和動物健康都能構成危害的一類致病菌，據世界衛(wèi)生組織報道，自二十世紀末以來，沙門菌對人類健康的威脅越來越大，已引起全球衛(wèi)生組織的重視。近年來，隨著進出口貿易日益繁榮，也使得沙門菌的全球性傳播成為可能，致使口岸出入境樣本檢測工作量急劇增加;而各口岸出入境工作人員結構組成復雜，流動快，難以控制，因此建立快速、準確、簡便的檢測方法保證進出口的安全性迫在眉睫。
　　本研究目的:擬以沙門菌腸毒素基因(Salmonella ent

2、erotoxin gene，stn)作為靶基因，建立檢測沙門菌的DNA環(huán)介導的恒溫擴增法《loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP)，對沙門菌屬進行特異性檢測，建立切實可行的快速沙門菌檢測技術并初步應用。
　　方法:1.在GenBank數(shù)據庫中檢索沙門菌屬stn基因核苷酸序列，提交到PrimerExplorerV4設計相應的LAMP引物，并通過Oligo6.0進行分析，以確

3、保引物之間無二聚體形成;應用BLAST程序，通過GenBank對引物及擴增產物進行同源性對比，經篩選獲得特異性內外引物各一對。
　　2.利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，使目的基因高效擴增。
　　3.對LAMP反應體系和反應條件進行優(yōu)化，在反應體系中添加SYBR-GreenⅠ熒光染料，結合顯色反應，使結果觀察直觀準確，能真正實現(xiàn)現(xiàn)場快速簡便檢測。
　　4.用沙門氏菌標準株和非沙門氏菌標準株

4、檢測方法的特異性和敏感性。與表型檢測方法顯色培養(yǎng)基法同時檢測肉、蛋、奶、水產品等樣品共計100份，檢測該方法的實用性。
　　結果:1.本研究建立的以沙門菌stn基因LAMP快速檢測方法，LAMP反應體積25μl，在最佳擴增溫度63℃恒溫條件下，時間60min內完成對沙門氏菌的檢測。
　　2.檢測沙門氏菌DNA最低濃度極值為1fg/ml，檢測沙門氏菌菌液最低濃度極值為10cfu/ml。對沙門氏菌株陽性檢出率100％，非沙門氏菌

5、株檢測均為陰性。
　　3.100份檢驗、檢疫樣品檢測結果與表型檢測方法顯色培養(yǎng)基檢測結果對比，一致率100％。
　　結論:本研究建立了沙門菌屬stn基因LAMP檢測方法，并應用于沙門菌屬標準株檢測及疑污染沙門菌的檢驗檢疫樣品檢測中，結果表明該法敏感性、特異性高，簡便快速，不需要昂貴的儀器設備，操作簡單，不易出現(xiàn)DNA污染。加入熒光染料顯色后，結果更易于觀察。確實能達到快速檢測沙門菌的目的，是一種適合口岸及基層檢驗、檢疫部門使