3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆與表達(dá).pdf

1、3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是菊酯類農(nóng)藥生物降解途徑中的第一個(gè)代謝產(chǎn)物。3-PBA的半衰期較菊酯類農(nóng)藥更長(zhǎng)(180d)，生物毒性更大，研究證實(shí)3-PBA具有抗雌激素的特性，可紊亂生物體內(nèi)分泌代謝。因此開展3-PBA的生物降解研究，克隆降解基因，對(duì)保障生態(tài)安全有重要意義。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的菊酯農(nóng)藥降解菌株4-D為出發(fā)材料，構(gòu)建4-D菌基因組文庫(kù)，以3-PBA為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板為篩選平板，通過(guò)混合池馴化篩選獲得可以3-P

2、BA作唯一碳源的重組菌4D-3-4，通過(guò)測(cè)序比對(duì)并分析插入片段，經(jīng)ORF分析得到921 bp的完整閱讀框，該核苷酸序列命名為D34(Genebank登錄號(hào)為KR024742)，經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)和生物軟件分析，其應(yīng)為鄰苯二酚雙加氧酶，是4-D菌降解3-PBA過(guò)程中起主要作用的基因。
　　運(yùn)用Swiss-Model對(duì)該基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行了氨基酸結(jié)構(gòu)分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。氨基酸序列長(zhǎng)度為306aa，Aligned蛋白數(shù)量為47，PDB結(jié)合

3、結(jié)構(gòu)數(shù)量為13，該蛋白不含二硫鍵，具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，酶活位點(diǎn)位于第一結(jié)構(gòu)域，第二結(jié)構(gòu)域與蛋白折疊和跨膜相關(guān)，其正確折疊需要Ca2+參與。
　　根據(jù)D34完整閱讀框序列設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端分別加上NdeⅠ和HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)，以原始菌株基因組DNA為模版，成功克隆到921 bp的D34基因序列。以pET-21b為載體，BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建了D34基因的非融合原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)重組表達(dá)菌株進(jìn)行了3-PBA的