3-苯氧基苯甲酸微生物分解代謝的調(diào)控機理研究.pdf

1、3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解的中間產(chǎn)物。從結(jié)構上看，它是二苯醚的衍生物，結(jié)構非常穩(wěn)定。研究其降解調(diào)控機制，有助于完整解析擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物降解途徑與機制，構建代謝網(wǎng)絡，進而也為菊酯類農(nóng)藥殘留的微生物修復供理論基礎。從基礎研究方面來看，對調(diào)控機理的解析可以拓展對微生物生理代謝過程的理解，豐富代謝調(diào)控的理論基礎。
　　本實驗室前期的研究中，分離到一株擬除蟲菊酯礦化菌株Sphingobium wenxini

2、aeJZ-1T，并先后從其中克隆鑒定了菊酯水解酶基因pytH和3-PBA1'，2'-雙加氧酶基因簇pbaA1A2BC，PytH催化菊酯生成二氯菊酸和3-PBA，該基因是組成型表達;pbaA1A2BC基因簇編碼的角度雙加氧酶催化3-PBA生成3-羥基苯甲酸和兒茶酚。在克隆pbaA1A2BC基因簇的過程中發(fā)現(xiàn)該基因簇和pytH不同，它并非組成型表達，而是受底物3-PBA的誘導，這一結(jié)果表明JZ-1T中存在對3-PBA特異響應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

3、
　　基于此結(jié)果，本文對3-PBA微生物降解過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機制進行研究。本研究意義在于深入理解細菌降解3-PBA的過程機制，利于菌株資源更加有效地運用;同時在理論上拓展對細菌分解代謝調(diào)控方式的了解。
　　1.Sphingobium wenxiniae JZ-1T中pbaA1A2B基因簇轉(zhuǎn)錄激活蛋白PbaR的鑒定
　　首先，以菌株Sphingobium wenxiniae JZ-1T為實驗材料，對其中的pbaA1A2

4、B以及pbaC基因的轉(zhuǎn)錄單位進行了鑒定，結(jié)果表明pbaA1，pbaA2和pbaB處于同一個轉(zhuǎn)錄單元中，pbaC則是另外一個獨立的轉(zhuǎn)錄單元。運用引物延伸實驗確定了其轉(zhuǎn)錄起始位點，pbaA1A2B的轉(zhuǎn)錄起始位點為起始密碼子上游48堿基處的“A”，pbaC基因的轉(zhuǎn)錄起始位點為起始密碼子上游33堿基處的“C”。運用軟件對pba基因簇啟動子區(qū)域的DNA元件進行了預測，包括-10 box，-35 box以及核糖體結(jié)合位點等。
　　運用DNA

5、affinity的方法純化得到pbaA1A2B啟動子DNA的特異性結(jié)合蛋白，得到的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳后將其中4條小于35 kDa的蛋白條帶切割出來進行了MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定，鑒定肽段與菌株基因組信息比對后發(fā)現(xiàn)其中有一個條帶的蛋白為IclR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因此推測此蛋白為調(diào)控pbaA1A2B基因簇轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，命名為PbaR。
　　對編碼PbaR蛋白的基因進行了敲除，敲除后的菌株失去了以3-PBA為唯一

6、碳源進行生長的能力，而回補進pbaR基因后，相應的菌株又恢復3-PBA同化能力。熒光定量PCR結(jié)果顯示pbaR基因敲除后pbaA1，pbaA2和pbaB基因的轉(zhuǎn)錄較野生菌JZ-1T明顯下降，同時也失去了對3-PBA誘導的響應，而pbaR回補菌株恢復了野生菌的特性，這些結(jié)果表明pbaR編碼一個轉(zhuǎn)錄激活蛋白，對3-PBA產(chǎn)生響應進而激活pbaA1A2B基因簇的表達。實驗結(jié)果同時表明，pbaR的缺失對pbaC基因的轉(zhuǎn)錄并沒有顯著的影響，說明P

7、baR并不調(diào)控pbaC基因。
　　將pbaR在大腸桿菌中大量表達并純化，純化的PbaR與pbaA1A2B以及pbaC啟動子DNA進行體外結(jié)合實驗，凝膠阻滯的結(jié)果顯示PbaR可以與pbaA1A2B的啟動子DNA結(jié)合但不能與pbaC基因的啟動子結(jié)合，而且這種結(jié)合是不依賴于底物3-PBA的。DNaseⅠ足譜印記實驗表明PbaR與pbaA1A2B啟動子DNA上的一段29-bp模塊結(jié)合，該DNA序列中存在一個10-bp的回文序列，破壞回文結(jié)

8、構后，PbaR就不能與相應的DNA結(jié)合，說明該回文序列在PbaR的識別中起到重要作用。對10 bp回文序列周圍的DNA進行突變后，PbaR與相應DNA能夠形成復合體，但是形成的復合體不穩(wěn)定，表明29-bp模塊中回文結(jié)構周圍的序列起到穩(wěn)定PbaR結(jié)合的作用。
　　PbaR與IclR家族調(diào)控蛋白有很多相同點，但是其與DNA的結(jié)合方式與已報到的其他蛋白有明顯差異。第一:其結(jié)合位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點與起始密碼子之間，該區(qū)域通常是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白

9、的結(jié)合位點;第二:該序列中只有一個回文序列結(jié)構，而該家族其他蛋白有很多是存在2-3個重復序列的結(jié)合模式;第三:回文序列周圍的DNA堿基對穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄蛋白的結(jié)合非常重要。PbaR的發(fā)現(xiàn)拓展了對該家族蛋白調(diào)控模式的認知。
　　2.細菌分解代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因組篩選系列質(zhì)粒pSRGFP-X的構建
　　同時本研究中分離到一株3-PBA降解菌株Sphingobium sp.TP316，其降解3-PBA的基因以及pbaR基因與上述的JZ-1

10、T菌株的100％相似，對其降解特性研究發(fā)現(xiàn)TP316在有果糖和3-PBA同時存在的培養(yǎng)基中會發(fā)生二次生長現(xiàn)象，這預示菌株TP316在降解3-PBA過程中可能存在分解代謝物阻遏的機制。依據(jù)苯甲酸降解的文獻報道，猜測調(diào)控pbaA1A2B基因簇的PbaR的編碼基因受到另外一個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。而通過上面的DNA affinity的方法并沒有鑒定到可能的調(diào)控蛋白。
　　因此為了尋找到調(diào)控pbaR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，構建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子正向篩選

11、系列質(zhì)粒pSRGFP-X。該質(zhì)粒的工作原理是在報告基因egfp前面連入研究基因的啟動子序列，運用相應的質(zhì)粒構建基因組文庫，基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與啟動子DNA之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關系，篩選熒光差異轉(zhuǎn)化子，得到陽性克隆。運用菌株Pseudomonas putidaKT2440中已經(jīng)報道的激活型benR-benABC以及阻遏型nicR-nicC調(diào)控系統(tǒng)對構建的pSRGFP-18質(zhì)粒進行驗證，結(jié)果表明構建的質(zhì)粒符合設計要求，可以運用到轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因的篩

12、選中。
　　3.pbaR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CbpR可能介導3-PBA降解過程的分解代謝物阻遏調(diào)節(jié)。
　　運用上面構建的pSRGFP-18質(zhì)粒篩選TP316菌株中pbaR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，得到一個陽性轉(zhuǎn)化子515-23，對其插入片段序列的分析顯示其中存在一個Crp/FNR家族轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為CbpR。
　　將cbpR基因敲除后，pbaR基因的表達與培養(yǎng)基中果糖的有無失去了相關性，其表達量在不同碳源的培養(yǎng)基中無顯著性

13、差異，而回補cbpR后，3-PBA為唯一碳源時pbaR基因則又恢復上調(diào)，一旦額外添加果糖，其表達就被抑制，說明回補菌株恢復了野生菌的代謝阻遏表型。pbaA2的表達表現(xiàn)出與pbaR類似的情況。這些結(jié)果說明cbpR編碼一個pbaR基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，而它對培養(yǎng)基中缺乏優(yōu)先碳源（果糖）產(chǎn)生響應。
　　凝膠阻滯實驗表明在體外，純化的CbpR可以與pbaR的啟動子結(jié)合，當不添加cAMP時，它們以寡聚體形式存在，而添加cAMP后則會形成多聚體

14、形式。推測CbpR在沒有cAMP結(jié)合的情況下可能會結(jié)合在pbaR的啟動子區(qū)域起到轉(zhuǎn)錄阻遏作用，而一旦結(jié)合了cAMP則變成轉(zhuǎn)錄激活因子。DNaseⅠ足譜印記表明CbpR與pbaR啟動子中一段23-bp的序列結(jié)合，該段序列與大腸桿菌中同源蛋白CRP的結(jié)合位點具有一定的相似性，表明CbpR結(jié)合位點可能具有保守性。
　　所以CbpR可能是一個cAMP結(jié)合蛋白，它可以對培養(yǎng)環(huán)境中是否存在優(yōu)先碳源產(chǎn)生響應，調(diào)控pba基因簇轉(zhuǎn)錄激活因子基因pb

15、aR的轉(zhuǎn)錄表達，在果糖充足時，細胞內(nèi)cAMP含量很低，CbpR阻遏pbaR的轉(zhuǎn)錄，而當果糖消耗完之后，細胞內(nèi)cAMP濃度增加，cAMP-CbpR則會激活pbaR基因的轉(zhuǎn)錄，表達的PbaR再對3-PBA產(chǎn)生響應從而激活pbaA1A2B基因簇的轉(zhuǎn)錄表達，這就是菌株TP316中果糖阻遏3-PBA分解代謝現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。
　　綜上所述，本文克隆鑒定了菊酯降解菌Sphingobium wenxiniae JZ-1T中3-苯氧基苯甲酸降解基因