桃果實(shí)膠質(zhì)降解相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、桃果實(shí)軟化是成熟過程中一個(gè)復(fù)雜而有序且是不可逆的過程,涉及一系列的生理生化反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致果實(shí)的耐藏性和抗病性下降,縮短貨架壽命。一般認(rèn)為,果實(shí)軟化與細(xì)胞壁中果膠類物質(zhì)的溶解和降解有關(guān),從而造成細(xì)胞彼此分離和胞壁總體結(jié)構(gòu)上的破壞。普遍認(rèn)為,果實(shí)軟化與細(xì)胞壁果膠降解酶的活性密切相關(guān),如多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、果膠裂解酶和β-半乳糖苷酶?？寺『捅磉_(dá)分析與桃果實(shí)果膠類物質(zhì)降解相關(guān)的酶類基因,有助于在分子水平上闡釋

2、這些酶在桃果實(shí)成熟軟化中作用,找出關(guān)鍵因子,為果實(shí)軟化調(diào)控、延長(zhǎng)果實(shí)保鮮期提供依據(jù)。
　　 本論文以‘雨花1號(hào)’桃果實(shí)為試驗(yàn)材料,通過同源克隆方法,獲得了與果膠降解相關(guān)的酶類基因,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,建立了半定量和熒光定量PCR技術(shù)體系,研究了各基因在非果實(shí)器官或組織、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及‘雨花1號(hào)’和‘京玉’采后成熟軟化進(jìn)程中的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.桃不同器官或組織的總RNA和DNA同時(shí)提取

3、　　 由于桃不同器官組織的發(fā)育程度不同,其含有多糖和多酚等次生代謝物質(zhì)的種類和含量存在著顯著差異,因而用一種方法從這些器官或組織中提取高質(zhì)量扣產(chǎn)量的總RNA和DNA是相當(dāng)困難的.經(jīng)過多次試驗(yàn),以‘雨花1號(hào)’桃為試驗(yàn)材料,研究出了一個(gè)能夠獲得大量并且具有高質(zhì)量的RNA和DNA同時(shí)提取方法,該方法適用于不同發(fā)育和貯存期桃果實(shí)中總RNA和DNA的提取,也適用于花、葉、莖、根等器官.利用這種改進(jìn)的提取方法,可以在1克鮮樣中提取到28-750μ

4、g總 RNA,30.46-137.04μg基因組總 DNA；A260/A280比值前者介于1.90與2.15之間,后者為1.81-1.94；且A260/A230的比值都大于2.0,表明所提取的RNA和DNA樣品較純凈,可用于基因克隆、基因組擴(kuò)增等分子生物學(xué)試驗(yàn)研究。
　　 2.桃果實(shí)果膠物質(zhì)降解相關(guān)基因的克隆和序列分析
　　 以‘雨花1號(hào)’桃果實(shí)室溫貯藏2 d的cDNA樣品為材料,通過同源比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,經(jīng)RT-PCR

5、獲得桃果實(shí)果膠質(zhì)降解相關(guān)基因的保守片段后,根據(jù)其序列信息,設(shè)計(jì)特異引物,利用RACE技術(shù),成功克隆了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(PpARF2)(GenBank登錄號(hào)EF568775)、果膠裂解酶(PpPEL1和PpPEL2)(GenBank登錄號(hào)分別為GU462127和EF568780)及β-半乳糖苷酶(PpGAL1和PpGAL2)基因(GenBank登錄號(hào)分別為EF568777和EF568776)的cDNA全長(zhǎng)序列,和β-半乳糖苷酶另一

6、基因(PpGAL3)的3’-RACE片段(GenBank登錄號(hào)GU462128)。并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其cDNA和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了理化性質(zhì)、功能域及與其它物種相應(yīng)序列的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。
　　 3.半定量和熒光定量PCR技術(shù)體系建立
　　 建立并完善了用于桃果實(shí)果膠物質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的半定量和熒光定量PCR技術(shù)體系,該體系具有良好的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性,通過溶質(zhì)桃中已知表達(dá)模式的兩個(gè)基因,內(nèi)切多聚半乳糖醛酸

7、酶基因和擴(kuò)展蛋白基因,驗(yàn)證了該體系的正確性。
　　 4.內(nèi)參基因穩(wěn)定性鑒定研究
　　 由于內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)環(huán)境條件下,其表達(dá)的穩(wěn)定性存在著很大的差異,因此,選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是 RT-qPCR試驗(yàn)成功的前提。對(duì)參試的11個(gè)內(nèi)參基因在‘雨花1號(hào)’和‘京玉’桃不同cDNA樣品中表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)RPL13和PLA2基因在不同樣品中表達(dá)水平差異較大,不適合做內(nèi)參基因；而常用于熒光定量表達(dá)分析的內(nèi)參基因18

8、S rRNA、GAPDH和ACT的表達(dá)穩(wěn)定性也比較差,也不適合做內(nèi)參基因；只有TEF2、UBQ10和RPⅡ基因,才在所有的供試樣品中表達(dá)穩(wěn)定,可以用于總樣品組合中桃果實(shí)果膠質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)分析,其中,TEF2和RPⅡ基因還可以用于其它任一分組樣品中熒光定量PCR數(shù)據(jù)的校正。
　　 5.桃果膠裂解酶基因表達(dá)特性分析
　　 以‘雨花1號(hào)’桃(溶質(zhì))采后分別用乙烯和1-MCP處理24 h,室溫貯藏6d的果實(shí)為試驗(yàn)材料,及不

9、經(jīng)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)處理和‘京玉’桃(硬桃)采后果實(shí)為對(duì)照樣品,同時(shí)還有‘雨花1號(hào)’桃的非果實(shí)器官或組織,采用半定量和熒光定量PCR對(duì)PpPELs的時(shí)空表達(dá)模式及其乙烯調(diào)控作用進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明,桃PpPELs主要在成熟果實(shí)中積累,其中PpPEL1在其它非果實(shí)器官及生長(zhǎng)發(fā)育期的果實(shí)中也有表達(dá),只是轉(zhuǎn)錄本含量較低；而PpPEL2只在采后的果實(shí)中表達(dá),且在整個(gè)貯藏期其轉(zhuǎn)錄本含量在兩個(gè)品種中均高于PpPEL1。PpPELs在‘京玉’桃采后

10、貯藏果實(shí)中表達(dá)水平的波動(dòng)性明顯小于‘雨花1號(hào)’,但采收當(dāng)天PpPEL1和PpPEL2的轉(zhuǎn)錄本含量,‘京玉’多于‘雨花1號(hào)’。乙烯和1-MCP的處理對(duì)PpPELs的表達(dá)沒有顯著影響,可能不受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 6.桃糖苷水解酶基因表達(dá)特性研究
　　 以乙烯和1-MCP分別處理24 h后,并在室溫下貯藏6 d的溶質(zhì)桃‘雨花1號(hào)’果實(shí)為試驗(yàn)材料,和不經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)處理及‘京玉’桃,另一品種類型——硬桃,采后室溫貯藏果實(shí)為對(duì)照

11、樣品,同時(shí)還有‘雨花1號(hào)’桃的非果實(shí)器官或組織,采用半定量和RT-qPCR對(duì)桃α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明,桃PpARF2、PpGAL1和PpGAL2主要在成熟器官或組織中積累,而PpGAL3主要在其它非果實(shí)器官及生長(zhǎng)發(fā)育期的果實(shí)中表達(dá),且在整個(gè)貯藏期內(nèi)前三者在‘雨花1號(hào)’桃果實(shí)中的表達(dá)量明顯高于‘京玉’。外源乙烯處理促進(jìn)了PpGAL2基因的表達(dá),抑制了PpARF2和PpGAL3基因轉(zhuǎn)錄

12、本的積累,卻對(duì)PpGAL1的作用較??；此外,PpARF2還表現(xiàn)出對(duì)乙烯濃度的敏感性,即中濃度促進(jìn)其表達(dá),而低或高濃度乙烯會(huì)抑制其表達(dá)。
　　 7.以溶質(zhì)桃‘雨花1號(hào)’和硬肉桃‘京玉’為試驗(yàn)材料,對(duì)桃果膠質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類和主成分分析研究。聚類分析結(jié)果表明,除PpGAL3外,其它在‘雨花1號(hào)’桃果實(shí)中的表達(dá)量要明顯高于‘京玉’,說明這些基因在桃果實(shí)采后成熟軟化中起到了不同程度的促進(jìn)作用。主成分分析表明,在供試的8個(gè)基