AvBD2在畢赤酵母中的組成型表達(dá)及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、雞β-防御素2(Chicken beta-defensins2，AvBD2)是一個(gè)富含半胱氨酸陽離子的小分子多肽，其成熟肽由39個(gè)氨基酸殘基組成，在雞的消化道組織中廣泛表達(dá)，且抗菌譜廣、抗菌活性較強(qiáng)，對雞的先天性免疫和獲得性免疫起著重要的作用。因此，AvBD2有望成為傳統(tǒng)抗生素的替代品而應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。
　　本實(shí)驗(yàn)以AvBD2為研究對象，利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成型表達(dá)載體pGHKα，構(gòu)建了雞AvBD2的畢赤酵母組成型表達(dá)系

2、統(tǒng)，并研究其表達(dá)產(chǎn)物活性；同時(shí)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化搖瓶發(fā)酵的接種量、裝液量和發(fā)酵溫度，為AvBD2的發(fā)酵生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，主要研究內(nèi)容如下：
　　1、AvBD2在畢赤酵母中的重組與組成型表達(dá)
　　依據(jù)NCBI中報(bào)道的AvBD2 cDNA編碼區(qū)序列(登錄號：NM_204992），參考畢赤酵母的密碼子偏愛性，合成pUC57-AvBD2克隆載體。使用EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切pUC57-AvBD2和載體pGHKα，回收

3、目的片段并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGHKα-AvBD2。經(jīng)SacⅠ和BglⅡ依次酶切pGHKα-AvBD2，使其線性化，去除其中Amp抗性基因。將線性化片段轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，根據(jù)其G418抗性及蛋白表達(dá)量，挑選出高表達(dá)菌株。表達(dá)上清經(jīng)Tricine-SDS-PAGE和Western Blot分析顯示，重組菌能夠分泌5.8kDa的AvBD2蛋白。
　　2、重組AvBD2的活性分析
　　將高表達(dá)菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，過夜培

4、養(yǎng)，濃縮發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌和溶血活性分析。瓊脂擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)的重組AvBD2蛋白對大腸桿菌、綠膿假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用；濃度為100、250和500mg/L的重組AvBD2總蛋白對2％?3%雞紅細(xì)胞的溶血率分別為0.74%、1.12%和2.17%。
　　3、重組AvBD2發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　將得到的高表達(dá)菌株于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，測定其生長曲線，結(jié)果表明培養(yǎng)20h的

5、重組菌，活力最強(qiáng)。首先對重組畢赤酵母發(fā)酵溫度、接種量、裝液量三個(gè)因素進(jìn)行獨(dú)立優(yōu)化，分別得到最優(yōu)的單因素水平；繼而通過響應(yīng)面法優(yōu)化，得出在14.44%的接種量、8.43%的裝液量、27.8℃的發(fā)酵溫度條件下，重組菌的表達(dá)量最大，較優(yōu)化前提高20%。
　　本研究以組成型表達(dá)載體pGHKα為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組AvBD2畢赤酵母工程菌；Tricine-SDS-PAGE和Western blot結(jié)果表明，重組酵母成功表達(dá)出目的蛋白；抗菌活性和溶