AvBD2在畢赤酵母中的組成型表達及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、雞β-防御素2(Chicken beta-defensins2,AvBD2)是一個富含半胱氨酸陽離子的小分子多肽,其成熟肽由39個氨基酸殘基組成,在雞的消化道組織中廣泛表達,且抗菌譜廣、抗菌活性較強,對雞的先天性免疫和獲得性免疫起著重要的作用。因此,AvBD2有望成為傳統(tǒng)抗生素的替代品而應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。
  本實驗以AvBD2為研究對象,利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成型表達載體pGHKα,構(gòu)建了雞AvBD2的畢赤酵母組成型表達系

2、統(tǒng),并研究其表達產(chǎn)物活性;同時,采用響應(yīng)面法優(yōu)化搖瓶發(fā)酵的接種量、裝液量和發(fā)酵溫度,為AvBD2的發(fā)酵生產(chǎn)及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù),主要研究內(nèi)容如下:
  1、AvBD2在畢赤酵母中的重組與組成型表達
  依據(jù)NCBI中報道的AvBD2 cDNA編碼區(qū)序列(登錄號:NM_204992),參考畢赤酵母的密碼子偏愛性,合成pUC57-AvBD2克隆載體。使用EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切pUC57-AvBD2和載體pGHKα,回收

3、目的片段并連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGHKα-AvBD2。經(jīng)SacⅠ和BglⅡ依次酶切pGHKα-AvBD2,使其線性化,去除其中Amp抗性基因。將線性化片段轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115,根據(jù)其G418抗性及蛋白表達量,挑選出高表達菌株。表達上清經(jīng)Tricine-SDS-PAGE和Western Blot分析顯示,重組菌能夠分泌5.8kDa的AvBD2蛋白。
  2、重組AvBD2的活性分析
  將高表達菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,過夜培

4、養(yǎng),濃縮發(fā)酵液上清進行抑菌和溶血活性分析。瓊脂擴散法抑菌實驗表明,表達的重組AvBD2蛋白對大腸桿菌、綠膿假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用;濃度為100、250和500mg/L的重組AvBD2總蛋白對2%?3%雞紅細胞的溶血率分別為0.74%、1.12%和2.17%。
  3、重組AvBD2發(fā)酵條件的優(yōu)化
  將得到的高表達菌株于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng),測定其生長曲線,結(jié)果表明培養(yǎng)20h的

5、重組菌,活力最強。首先對重組畢赤酵母發(fā)酵溫度、接種量、裝液量三個因素進行獨立優(yōu)化,分別得到最優(yōu)的單因素水平;繼而通過響應(yīng)面法優(yōu)化,得出在14.44%的接種量、8.43%的裝液量、27.8℃的發(fā)酵溫度條件下,重組菌的表達量最大,較優(yōu)化前提高20%。
  本研究以組成型表達載體pGHKα為基礎(chǔ),構(gòu)建重組AvBD2畢赤酵母工程菌;Tricine-SDS-PAGE和Western blot結(jié)果表明,重組酵母成功表達出目的蛋白;抗菌活性和溶

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