結(jié)核分枝桿菌ESAT6在畢赤酵母中的表達(dá)及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，與艾滋病和瘧疾一起成為當(dāng)今世界威脅人類健康的三大傳染病。近年來(lái)由于人口流動(dòng)增加、結(jié)核桿菌多重耐藥性的出現(xiàn)和卡介苗長(zhǎng)期繁衍、傳代導(dǎo)致保護(hù)性抗原不斷丟失、變異，最終使結(jié)核病的疫情再度加重，給結(jié)核病的防治提出新的挑戰(zhàn)。因此研制開發(fā)新型、安全、高效的結(jié)核病疫苗勢(shì)在必行。 ESAT6蛋白(早期分泌蛋白抗原靶6)是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中純化的一種分泌性蛋白，有特異的免疫原性，能刺激機(jī)體

2、產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。ESAT6分子量為6KD，其編碼基因全長(zhǎng)為288bp，可編碼95個(gè)氨基酸。它僅存在于結(jié)核分枝桿菌及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌中，而90％以上的非致病性分枝桿菌菌株缺失該蛋白。 Brandt等發(fā)現(xiàn)ESAT6是分枝桿菌感染的人或動(dòng)物免疫應(yīng)答過(guò)程中T細(xì)胞識(shí)別的主要靶抗原之一。同時(shí)Skiot發(fā)現(xiàn)ESAT6能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的IFN-γ，它在結(jié)核病的防治中發(fā)揮比較重要的作用。因此ESAT6蛋白可作為亞單位疫苗的組分以及

3、成為DNA疫苗的候選抗原，從而達(dá)到對(duì)結(jié)核病長(zhǎng)期、有效的預(yù)防。 目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在結(jié)核分枝桿菌ESAT6的高效表達(dá)及疫苗的研制方面進(jìn)行了許多研究，已取得了一系列研究成果。 目前基因工程中蛋白表達(dá)有多種體系，其中大腸桿菌是最為主要的表達(dá)系統(tǒng)。其主要優(yōu)點(diǎn)是成本低、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，而且蛋白的表達(dá)量低、活性差，因此人們轉(zhuǎn)向真核表達(dá)體系。 目前真核表達(dá)體

4、系中最常用的是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，人們利用它已成功地表達(dá)了多種外源蛋白。外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)分胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外兩種方式。胞內(nèi)表達(dá)適宜于通常在胞漿中表達(dá)或不含-S-S-鍵的非糖基化蛋白，但產(chǎn)物純化較復(fù)雜。 對(duì)于那些易于降解的不穩(wěn)定蛋白或具有毒素活性及對(duì)宿主菌有毒害作用的蛋白，胞內(nèi)表達(dá)可以將它們存儲(chǔ)在廣泛存在于甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)的特異性細(xì)胞分隔-過(guò)氧化物酶體中。巴斯德畢赤酵母包外分泌表達(dá)時(shí)只分泌很低水平的內(nèi)源蛋白，外源蛋白純化非

5、常方便，故分泌表達(dá)一般為優(yōu)先選擇的方式。 本研究主要目的是構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌ESAT6基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。以人結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增結(jié)核桿菌分泌性蛋白ESAT6基因，并連接到PGEM-T載體上。 在此基礎(chǔ)上將ESAT6基因連接到PpIczaA上，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體。將其線性化后，用電穿孔法導(dǎo)入Pichia Pastoris Gs115中。采用Zeoci

6、n進(jìn)行梯度篩選高抗性轉(zhuǎn)化子。以甲醇作為誘導(dǎo)物，取搖床發(fā)酵培養(yǎng)4d后的上清液，進(jìn)行SDS-PAGE。 同時(shí)為了提高蛋白的表達(dá)量，采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化畢赤酵母的發(fā)酵條件，其影響發(fā)酵的主要因素有：溶液pH值、甲醇加入量、溫度、發(fā)酵天數(shù)。最終得到重組畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中各項(xiàng)影響因素最佳值，即pH5.5，甲醇加入量為1％，溫度為30℃，時(shí)間為4d。 綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了ESAT6基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，獲得了具有生物活性的ESA