結核分枝桿菌ESAT6在畢赤酵母中的表達及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、結核病是一種由結核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，與艾滋病和瘧疾一起成為當今世界威脅人類健康的三大傳染病。近年來由于人口流動增加、結核桿菌多重耐藥性的出現和卡介苗長期繁衍、傳代導致保護性抗原不斷丟失、變異，最終使結核病的疫情再度加重，給結核病的防治提出新的挑戰(zhàn)。因此研制開發(fā)新型、安全、高效的結核病疫苗勢在必行。 ESAT6蛋白(早期分泌蛋白抗原靶6)是從結核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中純化的一種分泌性蛋白，有特異的免疫原性，能刺激機體

2、產生保護性免疫反應。ESAT6分子量為6KD，其編碼基因全長為288bp，可編碼95個氨基酸。它僅存在于結核分枝桿菌及少數幾種致病性分枝桿菌中，而90％以上的非致病性分枝桿菌菌株缺失該蛋白。 Brandt等發(fā)現ESAT6是分枝桿菌感染的人或動物免疫應答過程中T細胞識別的主要靶抗原之一。同時Skiot發(fā)現ESAT6能誘導機體產生高水平的IFN-γ，它在結核病的防治中發(fā)揮比較重要的作用。因此ESAT6蛋白可作為亞單位疫苗的組分以及

3、成為DNA疫苗的候選抗原，從而達到對結核病長期、有效的預防。 目前國內外學者在結核分枝桿菌ESAT6的高效表達及疫苗的研制方面進行了許多研究，已取得了一系列研究成果。 目前基因工程中蛋白表達有多種體系，其中大腸桿菌是最為主要的表達系統(tǒng)。其主要優(yōu)點是成本低、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達調控機制和蛋白質的加工修飾能力，而且蛋白的表達量低、活性差，因此人們轉向真核表達體系。 目前真核表達體

4、系中最常用的是畢赤酵母表達系統(tǒng)，人們利用它已成功地表達了多種外源蛋白。外源蛋白在畢赤酵母中的表達分胞內表達和分泌到胞外兩種方式。胞內表達適宜于通常在胞漿中表達或不含-S-S-鍵的非糖基化蛋白，但產物純化較復雜。 對于那些易于降解的不穩(wěn)定蛋白或具有毒素活性及對宿主菌有毒害作用的蛋白，胞內表達可以將它們存儲在廣泛存在于甲醇酵母細胞內的特異性細胞分隔-過氧化物酶體中。巴斯德畢赤酵母包外分泌表達時只分泌很低水平的內源蛋白，外源蛋白純化非

5、常方便，故分泌表達一般為優(yōu)先選擇的方式。 本研究主要目的是構建結核分枝桿菌ESAT6基因真核表達載體并轉入畢赤酵母中進行表達，同時對表達條件進行優(yōu)化。以人結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴增結核桿菌分泌性蛋白ESAT6基因，并連接到PGEM-T載體上。 在此基礎上將ESAT6基因連接到PpIczaA上，構建畢赤酵母表達載體。將其線性化后，用電穿孔法導入Pichia Pastoris Gs115中。采用Zeoci

6、n進行梯度篩選高抗性轉化子。以甲醇作為誘導物，取搖床發(fā)酵培養(yǎng)4d后的上清液，進行SDS-PAGE。 同時為了提高蛋白的表達量，采用正交實驗來優(yōu)化畢赤酵母的發(fā)酵條件，其影響發(fā)酵的主要因素有：溶液pH值、甲醇加入量、溫度、發(fā)酵天數。最終得到重組畢赤酵母發(fā)酵過程中各項影響因素最佳值，即pH5.5，甲醇加入量為1％，溫度為30℃，時間為4d。 綜上所述，本研究實現了ESAT6基因在畢赤酵母中的分泌表達，獲得了具有生物活性的ESA