AvBD2在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)及功能分析.pdf

1、雞β-防御素2（chicken beta-defensin2，AvBD2）是一種由39個(gè)氨基酸構(gòu)成的富含半胱氨酸的小分子多肽，對(duì)病原微生物具有較強(qiáng)的殺傷作用，在雞的免疫系統(tǒng)中具有重要作用。
　　本研究以雞AvBD2為研究對(duì)象，參考大腸桿菌偏愛密碼子，人工合成雞AvBD2成熟肽基因，并構(gòu)建串聯(lián)表達(dá)載體pET-28a-AvBD2op-AvBD2，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，再通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，經(jīng)鎳柱純化后進(jìn)行W

2、estern Blot檢測(cè)、Tricine-SDS-PAGE電泳分析和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，并對(duì)純化后蛋白的抑菌活性進(jìn)行了初步研究。
　　主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.雞β-防御素2成熟肽基因的設(shè)計(jì)與合成
　　參照大腸桿菌偏愛密碼子，在不改變其氨基酸序列的情況下，根據(jù)Genbank中發(fā)表的雞AvBD2 cDNA編碼區(qū)序列（NM_204992），將大腸桿菌的稀有密碼子更換為偏愛密碼子，人工合成大腸杠菌偏愛密碼

3、子優(yōu)化的成熟肽基因序列AvBD2op，序列兩端分別添加BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建克隆載體pMD18-Tsimple-AvBD2op；人工合成雞β-防御素2成熟肽基因序列，序列兩端分別添加Not I和EcoR I酶切位點(diǎn)，合成成功后將其克隆至pMD18-Tsimple載體上構(gòu)建克隆載體pMD18-Tsimple-AvBD2。
　　2.雞β-防御素2融合蛋白的串聯(lián)表達(dá)及純化
　　pMD18-Tsimple-AvBD

4、2op和pET-28a用BamHI和EcoR I雙酶切后連接，構(gòu)建AvBD2op表達(dá)載體pET-28a-AvBD2op。在此基礎(chǔ)上，用Not I和EcoR I雙酶切pET-28a-AvBD2op和pMD18-Tsimple-AvBD2，構(gòu)建串聯(lián)表達(dá)載體pET-28a-AvBD2op-AvBD2。PCR鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子增菌后提取質(zhì)粒測(cè)序，挑取陽性轉(zhuǎn)化子克隆培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用鎳柱進(jìn)行純化，并用BCA法測(cè)定純化后

5、的蛋白濃度。
　　經(jīng)Western Blot蛋白檢測(cè)，單表達(dá)工程菌和串聯(lián)表達(dá)工程菌均在9500Da處有著特異性條帶，證明了目的蛋白AvBD2在大腸桿菌工程菌均實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。BCA法測(cè)得串聯(lián)表達(dá)載體 pET-28a-AvBD2op-AvBD2工程菌純化后的蛋白濃度為0.304 mg/mL。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析結(jié)果表明，單表達(dá)蛋白產(chǎn)物分子量為4339.8Da，串聯(lián)表達(dá)分子量為8385.6Da，此分子量均與蛋白的理論分子量

6、相符。
　　3.雞β-防御素2融合蛋白功能評(píng)價(jià)
　　用瓊脂孔穴擴(kuò)散抑菌法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物體外抑菌活性，結(jié)果顯示AvBD2融合蛋白對(duì)糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC29212）、大腸桿菌（Escherichia coli CMCC44102）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853）、甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonellaparatyphi ATCC9150）

7、、巴氏桿菌（Pasteurella）及乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella Paratyphi B CMCC50094）具有一定的抑菌活性。
　　研究表明，本論文成功構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)載體pET-28a-AvBD2op-AvBD2，用Western Blot方法、Tricine-SDS-PAGE電泳分析和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析法證明該載體在大腸桿菌工程菌中成功表達(dá)出了AvBD2，表達(dá)產(chǎn)物通過鎳柱純化，得到的純化蛋白經(jīng)瓊脂