葡萄硝酸還原酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及測(cè)定條件的優(yōu)化.pdf

1、硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)可以把硝酸鹽通過(guò)氧化還原的作用還原成沒(méi)有毒害作用的NO2-。提高果蔬里硝酸還原酶的活性，可以使果蔬內(nèi)硝酸鹽含量下降，還可以提高氮肥利用率，提高其產(chǎn)量。另外，還有報(bào)道稱(chēng)，硝酸還原酶和籽粒的產(chǎn)量以及蛋白質(zhì)的含量是呈正相關(guān)的，硝酸還原酶可以為育種中籽粒產(chǎn)量和蛋白含量篩選的生化指標(biāo)。還有報(bào)道稱(chēng)NR和NO與植物抗逆性有關(guān)。了解植物硝酸還原酶催化亞硝酸鹽還原成一氧化氮以及一氧化氮在植物逆境中的作

2、用，可以為緩解脅迫條件下活性氧對(duì)植物體的傷害提供思路。
　　本研究對(duì)來(lái)自于葡萄的硝酸還原酶VVNR1(Genbank NP_001268049.1)的氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化遺傳密碼子和核苷酸結(jié)構(gòu)，然后利用PTDS法合成葡萄硝酸還原酶基因并重新命名為VVNR1I。然后，將PTDS法合成的VvNR1I基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母，并使其在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)里分泌表達(dá)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)將VvNR1I基因連接到克隆載體pPIC9K上，構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pYN723

3、9。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，甲醇誘導(dǎo)重組硝酸還原酶高效表達(dá)。最后，我們從培養(yǎng)基中添加KNO3的濃度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、金屬離子等四方面，對(duì)葡萄硝酸還原酶測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，葡萄硝酸還原酶VvNR1I的最佳培養(yǎng)時(shí)間為48 h。在48 h之前，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，葡萄硝酸還原酶活性不斷增強(qiáng)，48h達(dá)到最高峰，隨后葡萄硝酸還原酶活性逐漸減弱。當(dāng)pH值為6左右時(shí)，葡萄硝酸還原酶表現(xiàn)出最大活性。pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)，對(duì)葡萄硝

4、酸還原酶活性均有抑制作用。培養(yǎng)基中一定的硝酸鉀濃度范圍里，VvNR1I的活性會(huì)隨著KNO3濃度的增加而增強(qiáng);當(dāng)培養(yǎng)基中KNO3濃度大于1％時(shí)，濃度在繼續(xù)增加對(duì)葡萄硝酸還原酶活性影響不大。Mo6+對(duì)葡萄硝酸還原酶VvNR1I的活性促進(jìn)作用比較明顯，這可能與鉬是硝酸還原酶活性和固氮酶等含鉬酶類(lèi)的重要組成成分有關(guān)。
　　本研究構(gòu)建了葡萄硝酸還原酶表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，進(jìn)而研究葡萄硝酸還原酶的最佳測(cè)定條件，為深入探究葡萄硝酸