分泌性表達人rPA畢赤酵母菌株的構建及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、血栓病是人類面臨的一類主要疾病，包括急性心肌梗塞、腦血栓、肺靜脈血栓、動脈血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞(AMI)的死亡率高達30％。 溶纖治療被認為是治療血栓病最為有效的方法。尋找、研制效果好、副作用小的治療藥物一直是世界范圍的熱門課題。其中占中心地位的是纖溶酶原激活劑(plasminogenactivator簡稱PA)，PA作為溶血栓藥物的機理在于它能激活血纖溶酶原(plasminogen簡稱Pg)成為血纖溶酶(pla

2、smin)，后者能夠降解構成血栓骨架的血纖蛋白(fibrin)，從而消除血栓。 所謂溶纖能力包括了藥物溶解血栓的速率、徹底性和再栓塞發(fā)生率等方面。一個好的溶纖劑能夠溶解陳舊或新鮮的血栓，再栓塞率低。 國內(nèi)、外進入臨床應用和正在研制的溶纖藥物基本分為三代：第一代溶栓劑包括鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)，它們雖然具有較好的溶栓效果，但缺少纖維蛋白的選擇性，除了能激活血栓表面的纖溶酶原外也能激活血漿中游離的纖溶酶原。使α2-抗

3、纖溶酶大量消耗及纖維蛋白原降解，引起全身出血性副作用。 第二代溶栓劑包括組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，尿激酶原(Pro-UK)等。t-PA和Pro-UK在體外和動物實驗中都有明顯的纖維蛋白親和性，出血性副作用較小，體外無溶栓活性，進入血液后，與纖維蛋白結合后發(fā)生脫?；夥磻纬捎谢钚缘腟K-纖溶酶原復合物，激活纖溶酶原。但存在體內(nèi)半衰期短，給藥時間長，再栓率高等缺點。 第三代溶栓藥物包括TNK-PA，STAR，rP

4、A等以及正在研制的一些新型溶栓劑。它們基本具備以下特點：溶栓能力強，出血性副作用低，在血液中的半衰期長，總使用劑量少，治療費用低等。 第一代溶栓藥物具有自身難以克服的缺陷，如出血、副作用大等，已被淘汰。第二代溶栓劑已有所改進，但還不理想。目前國際上正在致力于用蛋白質工程手段開發(fā)第三代溶栓劑。研究方向是在增強或保持其催化活性前提下，通過對某些特定氨基酸殘基的突變或是通過相關結構域的刪除、增加或融合等手段，達到以下目標：1.提高對纖

5、維蛋白的選擇性；2.提高對纖溶酶原激活劑抑制劑的抗性；3.延長其在血液循環(huán)中的半衰期；4.增強其溶栓能力。rPA是由t-PA經(jīng)基因工程改造的缺失突變體，僅包括t-PA的Kringle-2和蛋白酶區(qū)，其主要優(yōu)點是延長了體內(nèi)半衰期，減少了血液清除率，降低了出血性等副作用。被公認為是安全、有效的溶栓藥物。 目前國內(nèi)尚沒有rPA上市，而國外上市的rPA是通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得，表達產(chǎn)物含355個氨基酸的非糖基化單鏈分子，分子量約39k

6、D，含9對二硫鍵，多以包涵體形式存在，產(chǎn)品提取和純化過程需經(jīng)過復雜的變、復性條件，多二硫鍵極易形成錯配和不穩(wěn)定，純化過程回收率往往低于表達量的10％。此外大腸桿菌細胞壁脂多糖是藥品內(nèi)毒素的主要來源，rPA單劑用量通常又是其它重組蛋白如rhG-CSF，INFα-2b單劑用量的30倍以上，因而產(chǎn)品要求純度高，內(nèi)毒素含量低，這無疑又加大了下游純化工藝的難度，增加藥物成本。為克服上述缺點，尋求新的表達系統(tǒng)是急需解決的問題之一。巴氏畢赤酵母(Pi

7、chiapastoris)是一種甲醇酵母，其細胞過氧化物酶中含甲醇代謝途徑必需的醇氧化酶。AOX1為強誘導啟動子，受甲醇誘導，易于調(diào)控外源基因表達，并且表達效率高。巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)作為真核生物，能對外源真核生物基因表達產(chǎn)物進行正確翻譯和翻譯后加工。甲醇營養(yǎng)型酵母與分泌型酵母表達質粒整合重組，已成功分泌表達許多外源蛋白。本文通過PCR擴增得到(rPA)基因片斷，將該基因片斷插入到含有AOX1啟動子和α分泌性信號

8、肽序列載體pPIC9K中，構建了重組表達質粒pPIC9K/rPA，轉化PichiapastorisGS115宿主菌。通過比較轉化子在MM和MD平板上的生長狀況，篩選His+Muts表型轉化子。并在2.0mg/mLG418平板上篩選得到多拷貝轉化子GR10，GR11。搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，結果表明重組蛋白分子量約39kD，能與特異性單克隆抗體發(fā)生免疫反應；采用L9(34)正交試驗優(yōu)