硒結(jié)合蛋白1生物功能及抗腫瘤作用機理的研究.pdf

1、硒做為一種人體必須的微量元素對于人體各種機能的提高和多種疾病的預防和治療都具有潛在的重要價值，長期較低的硒攝入量對人體健康具有多種不利的影響。由于我國約有70％的土地處在全球的缺硒帶上，其上產(chǎn)出的各種動、植物和微生物產(chǎn)品都屬于缺硒產(chǎn)品，而無機硒的攝入又會對人體產(chǎn)生多種毒副作用，因此硒蛋白做為一種有機硒的代表成為各種富硒食品和硒相關(guān)藥品研究的熱點。然而硒蛋白的生物功能多樣，作用靶點廣泛，具體抗病機制尚不清楚，阻礙了其在醫(yī)藥和食品中的進一步

2、應(yīng)用，因此對硒蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及抗病分子機制的研究具有重要意義。
　　硒結(jié)合蛋白1(SBP1)做為一種新型的含硒蛋白可能參與了人體細胞高爾基體蛋白運輸?shù)榷鄠€重要的生化進程，并通過與多種其它蛋白的相互作用影響細胞內(nèi)的信號傳導發(fā)揮其潛在的抑癌功能。本研究旨在通過蛋白組學的方法對SBP1的生物功能進行研究揭示其參與癌癥發(fā)生的具體信號通路和分子機制，并通過SBP1與谷胱甘肽過氧化物酶(GPx1)的相互作用研究以及兩者與硒的協(xié)同作用揭示新的

3、腫瘤發(fā)病機制，進一步了解SBP1的結(jié)構(gòu)，并為硒所介導的個性化腫瘤預防提供重要的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果分述如下:
　　1.研究了SBP1在體內(nèi)和體外對腫瘤細胞生物學行為的影響
　　利用誘導型病毒載體pRetroX-Tight-Pur構(gòu)建了SBP1哺乳動物細胞誘導質(zhì)粒pRetroX-Tight-Pur-SBP1，并通過單克隆篩選得到了SBP1穩(wěn)轉(zhuǎn)誘導結(jié)腸癌細胞HCT116-TetSBP1。使用該細胞在體外培養(yǎng)條件下大量誘導SBP

4、1蛋白的表達，并測定腫瘤細胞各種生物學行為的變化。通過對細胞增殖，細胞遷移和細胞凋亡的檢測發(fā)現(xiàn)SBP1的誘導表達對體外培養(yǎng)腫瘤細胞的增殖和遷移影響不大，能夠誘導部分細胞發(fā)生凋亡但效果不顯著。將誘導SBP1表達的HCT116-TetSBP1細胞注射到裸鼠體內(nèi)，并在體內(nèi)維持SBP1的誘導表達，檢測其對腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)誘導SBP1表達不僅顯著抑制了腫瘤細胞在裸鼠皮下的生長而且顯著減少了腫瘤細胞向肺部的轉(zhuǎn)移。
　　2.利

5、用iTRAQ蛋白組學的方法研究了SBP1的體內(nèi)抑癌功能
　　從裸鼠皮下種植瘤形成的腫瘤組織中提取蛋白，使用iTRAQ蛋白組學的方法鑒定差異表達的蛋白，結(jié)果共鑒定到1975個蛋白，其中差異顯著蛋白132個(p＜0.05）。通過生物信息學GO生物功能分析和KEGG信號通路分析，篩選到了13個細胞脂代謝相關(guān)蛋白，其中5個為表達上調(diào)蛋白包括DKK1，HSP60，DHCR7，ANXA4和 AGPAT5;8個為表達下調(diào)蛋白包括LPCAT2，G

6、Px5，GAPDH，NME2，ALDH2，BPIFA3，PPIA和FABP4。另外篩選到7個細胞糖代謝相關(guān)蛋白包括GAA，GAPDH，ALDH2，TXN，ENO3，UGDH和LUM，全部為表達下調(diào)蛋白。對iTRAQ實驗結(jié)果進行了Westernblotting驗證，顯示iTRAQ分析結(jié)果準確可靠。
　　通過檢測多種信號通路蛋白表達的變化，表明SBP1對細胞脂代謝和糖代謝以及癌癥相關(guān)的多重信號通路都有影響。由此推測SBP1通過影響細胞

7、糖代謝和脂代謝相關(guān)蛋白的表達參與了細胞內(nèi)多個信號通路的信號傳導，包括EMT通路、WNT信號通路、JNK信號通路、NOTCH信號通路和NFkB信號通路，并通過這些癌癥相關(guān)信號通路引起一系列下游蛋白的激活或抑制，從而發(fā)揮其抑癌功能。
　　3.研究了SBP1硒結(jié)合位點對其功能的影響
　　對SBP1硒結(jié)合位點第57位氨基酸進行了單核苷酸突變，使其密碼子由TGC突變?yōu)镚GC，編碼的氨基酸由半胱氨酸(Cys，C)突變?yōu)楦拾彼?Gly,G

8、)，去除了原有氨基酸上的一個巰基，使得SBP1失去了結(jié)合硒的能力，而對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不會產(chǎn)生太大的影響。構(gòu)建了突變SBP1哺乳動物細胞表達質(zhì)粒pIRES2-SBP1C57G，將其轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌細胞HCT116檢測對SBP1功能的影響。結(jié)果顯示:(1)硒造成的細胞毒性在有SBP1表達的細胞中導致的死亡率為38.2％，而在SBP1C57G表達的細胞中導致的死亡率為64.4％，因此SBP1C57G的點突變顯著降低了SBP1對細胞的保護作用;(2)

9、通過不同MCF7細胞中SBP1半衰期的檢測，表明兩種不同多態(tài)性的GPx1蛋白(GPx1A5P和GPx1A7L)的存在都會將SBP1蛋白的半衰期從45h延長到60h左右，而SBP1C57G的半衰期在GPx1存在時依然會從60h減少到45h，表明SBP1硒結(jié)合位點的突變破壞了這兩種蛋白之間的結(jié)合;(3)通過多個信號通路蛋白和細胞內(nèi)ATP含量的檢測，表明SBP1C57G引起了細胞ATP總含量的降低，進而導致不依賴于信號通路的多個蛋白磷酸化的減

10、少。
　　4.研究了SBP1和GPx1兩種蛋白在體外的相互作用
　　構(gòu)建了大腸桿菌重組表達載體pQE80L-SBP1和pQE80L-GPx1，并利用大腸桿菌表達宿主SoluBL21實現(xiàn)了SBP1的可溶性表達。通過鎳柱純化和分子篩純化方法分別得到了電泳純的SBP1蛋白和GPx1蛋白。利用兩種純化蛋白在體外進行相互作用后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Superdex200凝膠層析的洗脫時間從原有的34 min(SBP1)和30 min(GPx1)分