硒-藻藍(lán)蛋白綴合物的制備及抗腫瘤活性研究.pdf

1、背景與目的： 藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中，是藻類特有的捕光色素蛋白。由于藻藍(lán)蛋白具有對光能吸收傳遞的特殊性質(zhì)，已被用來作為腫瘤激光治療的光敏劑。藻藍(lán)蛋白帶有熒光，可制成熒光標(biāo)記物，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中。近期的研究顯示，藻藍(lán)蛋白還具有一系列重要的生理活性，其中對腫瘤細(xì)胞的抑制作用受到關(guān)注，為了提高抗腫瘤活性，富硒藻藍(lán)蛋白的研究也日益活躍。 硒是人體

2、必需的微量元素，具有重要的生理功能和廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)能夠控制紅色元素硒原子的聚合，形成以蛋白為核心、硒為膜，或者以蛋白質(zhì)為分散劑的硒納米粒子。該粒子粒徑20-60nm，呈紅色，易溶于水，對熱穩(wěn)定，不會轉(zhuǎn)化成灰色、黑色元素硒，并且對小鼠具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤等生物活性。 藻藍(lán)蛋白雖然具有生物活性，但普遍認(rèn)為不如螺旋藻多糖顯著。為了提高其生物活性，目前的研究多集中于生物富集硒，即在培養(yǎng)螺旋藻的環(huán)境中

3、加入含硒物質(zhì)，使硒在螺旋藻體生長過程中被利用并富集于細(xì)胞內(nèi)。此種方法所得到的藻體中各部分均含有硒元素，且較難準(zhǔn)確控制藻藍(lán)蛋白與硒的比例。本實(shí)驗(yàn)采用藻體外綴合的方法，將純化后的藻藍(lán)蛋白與一定比例的硒作用，從而得到硒-藻藍(lán)蛋白綴合物，能夠準(zhǔn)確控制硒在綴合物中的含量，并得到單一的硒-藻藍(lán)蛋白，純度高，操作較為簡便。 藻藍(lán)蛋白和硒都具有抗腫瘤活性，而許多硒.蛋白質(zhì)復(fù)合物也都表現(xiàn)出一定的抑瘤作用。我們有理由假設(shè)硒-藻藍(lán)蛋白綴合物因協(xié)同作用

4、而使其抗腫瘤活性更強(qiáng)、對機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞程度更低。本實(shí)驗(yàn)對硒.藻藍(lán)蛋白綴合物、藻藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性進(jìn)行探究和對比，期望得到既有較好的抗腫瘤活性，又能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、最大限度減少對機(jī)體損害的新型活性物質(zhì)。 方法： 1.采用細(xì)胞破碎、鹽溶、鹽析等方法，從螺旋藻中提取藻藍(lán)蛋白粗品，探索高提取率、大規(guī)模提取的實(shí)驗(yàn)條件。 2.設(shè)計雙水相萃取法最佳方案，純化PC。以紫外-可見吸收光譜、等電點(diǎn)聚焦電泳檢測PC的純度。

5、 3.Se(IV)與PC進(jìn)行綴合作用，并對所得綴合物Se-PC進(jìn)行表征(主要為紫外-可見吸收光譜和紅外吸收光譜)，并與單純PC進(jìn)行比較。 4.KM小鼠隨機(jī)分組，檢驗(yàn)PC、Se-PC對荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用。 5.以CY_為陽性對照組，考察PC、Se-PC各劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)變化，對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。 結(jié)果： 1.ATPE法純化PC最佳條件如下：PEG-4000(w/w)15％，KPi(w/

6、w)16％(K2HPO4與KH2PO4質(zhì)量比為35:65)，pH=6.28，PC粗提液(w/w)10％。PC粗品經(jīng)此ATPE體系純化3次純度可達(dá)3.83，回收率23.99％。經(jīng)超濾后純度可達(dá)到4.04。 2.純化后的藻藍(lán)蛋白測定紫外可見吸收光譜，在278nm、360nm和620nm處有特征吸收峰，等電點(diǎn)聚焦電泳測得等電點(diǎn)為4.3。主要技術(shù)指標(biāo)與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果基本一致，說明PC提取純化技術(shù)成熟，結(jié)果穩(wěn)定。 3.Se-

7、PC與PC的紫外-可見吸收光譜相比較，620 nm處的特征吸收下降，下降幅度與作用時間、Se(IV)和PC的摩爾比正相關(guān)；278 nm和384 nm處的吸收則隨Se(IV)和PC摩爾比的增加和作用時間的延長而增大。紅外光譜圖中，PC的酰胺I帶為1653.2cm-1，為α螺旋，而Se-PC綴合物的酰胺I帶為1647.0cm-1，屬無規(guī)則卷曲。 4.PC50 mg/kg/d、75 mg/kg/d、100 mg/kg/d給藥組，抑瘤率

8、分別為25.0％、293％、41.2％；Se-PC50 mg/kg/d、75 mg/kg/d、100 mg/kg/d給藥組，抑瘤率分別為33.6％、37.9％、40.8％。且PC、Se-PC各劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均有所增加。 結(jié)論： 1.與傳統(tǒng)柱層析法相比，雙水相萃取法純化PC的優(yōu)勢明顯。ATPE法操作簡單，耗時短，每次處理樣品量大，能夠最大限度地保留。PC的活性，適合較大體積PC粗提液的純化工作。 2

9、.綴合物在278 nm處吸光值的增加說明，隨著綴合作用的進(jìn)行，PC的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使原來位于分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸暴露于分子表面。 3.PC、Se-PC均具有一定的抗腫瘤活性，且抑瘤率均與給藥量正相關(guān)，最佳抑瘤效果均出現(xiàn)在100 mg/kg給藥組，PC組為41.2％，Se-PC組為40.8％。 4.PC、Se-PC對小鼠免疫器官胸腺、脾臟均有一定的保護(hù)促進(jìn)作用。與CY相比，雖然PC、Se-PC中低劑量組腫瘤抑