腫瘤抑制蛋白APC與Amer1的結(jié)合機(jī)理研究.pdf

1、APC(adenomatous polyposis coli,APC)是一個(gè)全長2843個(gè)氨基酸的多結(jié)構(gòu)域蛋白,是Wnt信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑,能夠和很多蛋白相互結(jié)合以發(fā)揮作用。其N端含有一個(gè)最保守的ARM(Armadillo repeats)結(jié)構(gòu)域。我們試驗(yàn)中用到的407-775片段就包含了此結(jié)構(gòu)域,它能與許多蛋白結(jié)合并發(fā)揮功能。Amerl蛋白包含1135個(gè)氨基酸,根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示其不含有顯著的功能性結(jié)構(gòu)域,據(jù)報(bào)道Amerl含有

2、三個(gè)與APC結(jié)合的位點(diǎn):Al,280-368; A2,380-531; A3,716-834。
　　本論文中,我們首先通過BLAST與Alignment的方法得到了Amerl365-375這一保守片段,其中325-335是其中第一個(gè)能與APC結(jié)合的保守序列(數(shù)據(jù)待發(fā)表),由于Tanneberger, K.等人在劃分Amerl的區(qū)間片段時(shí)Al截止在了第368個(gè)氨基酸上,所以使得365-375這一保守序列被直接的忽略了,而我們有幸找到

3、了這段序列,做了GST-Pulldown與ITC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了他們的結(jié)合。并且拿到了APC-ARM與Amerl365-375片段的晶體,解析了兩者的空間結(jié)構(gòu)。
　　接下來我們試圖得到APC-ARM與A3復(fù)合物的晶體時(shí),對 A3的片段不能準(zhǔn)確的定位,于是再次通過BLAST與Alignment找出Amerl中此片段的保守區(qū)域。根據(jù)結(jié)果我們構(gòu)建、表達(dá)純化了帶G S T標(biāo)簽的A m e r l片段716-834、766-823、766-777

4、、786-823、766-823A778-794。通過GST-Pulldown與ITC實(shí)驗(yàn)證實(shí)了以上最短的片段Amerl766-823A778-794能夠與APC-ARM結(jié)構(gòu)域結(jié)合,而且片段766-777與786-823均不能與此結(jié)合。由此可知,Amerl與APC-ARM相結(jié)合的四個(gè)位點(diǎn)中A3片段的結(jié)合方式是獨(dú)特的,它不僅僅是依靠像Al、A2、A4那樣的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸與APC-ARM相結(jié)合,而是采用兩端的氨基酸形成一定的高級結(jié)構(gòu),再通過