油酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的調(diào)節(jié)及CDK5-PPARγ介導(dǎo)的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素敏感性、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。膳食脂肪酸是影響脂聯(lián)素分泌的重要因素，油酸為單不飽和脂肪酸，在體內(nèi)可調(diào)節(jié)血糖血脂、改善內(nèi)皮功能、抗炎等。油酸調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的具體作用存在爭議，且調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是核轉(zhuǎn)錄受體，其反應(yīng)元件PPRE存在于脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子上，PPARγ激動(dòng)劑可通過上調(diào)PPARγ促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的

2、肥胖小鼠體內(nèi)CDK5被異常激活，可通過對(duì)PPARγ273位絲氨酸磷酸化下調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，故油酸對(duì)脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用是否同樣通過PPARγ或者CDK5/PPARγ途徑而實(shí)現(xiàn)，有待系統(tǒng)深入地研究。
　　目的：
　　用不同濃度油酸作用于誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，觀察油酸在不同濃度下對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ、CDK5等相關(guān)分子的作用，全面系統(tǒng)地探討油酸對(duì)脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用;并選擇可明顯調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的油酸濃度，分別研究不同油酸調(diào)節(jié)脂聯(lián)

3、素的分子機(jī)制，為指導(dǎo)肥胖及代謝相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞，用不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的油酸處理細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組（單純加入PPARγ激動(dòng)劑Rosoglitazone，可促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)），通過real-time PCR及Western-blot測(cè)定胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ、CDK5mRNA及蛋白表達(dá)。

4、>　　2.選擇最能影響脂聯(lián)素表達(dá)的油酸濃度處理細(xì)胞，通過real-time PCR及Western-blot測(cè)定脂聯(lián)素、PPARγ、CDK5mRNA及蛋白表達(dá)，及PPARγser273磷酸化水平。
　　3.在適宜濃度(100μmol/L)油酸中加入或不加入PPARγ抑制劑GW9662處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組及抑制劑對(duì)照組（單純加入GW9662），通過real-time PCR及Western-blot測(cè)定脂聯(lián)素、PPARγmR

5、NA及蛋白表達(dá)，及PPARγser273磷酸化水平。
　　4.在高濃度(400μmo1/L)油酸中加入或不加入CDK5活性抑制劑Roscovitine處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組及抑制劑對(duì)照組（單純加入Roscovitine），通過real-time PCR及Western-blot測(cè)定脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)，及PPARγser273磷酸化水平、p-CDK5(15Tyr)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度油酸對(duì)

6、脂聯(lián)素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用不同，50、100μmol/L油酸可同時(shí)促進(jìn)脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)(P＜0.01;P＜0.01)，200μmol/L油酸可促進(jìn)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)(P＜0.05）;在100μmol/L時(shí)促進(jìn)作用最明顯，隨濃度升高油酸對(duì)脂聯(lián)素的促進(jìn)作用下降，在400μmol/L時(shí)抑制脂聯(lián)素mRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.01;P＜0.05)。
　　2.油酸在50、100μmol/L時(shí)可上調(diào)PPARγmRNA(P＜0.01;P＜0.

7、01)及蛋白表達(dá)(P＜0.01;P＜0.01)，在100μmol/L時(shí)對(duì)PPARγ表達(dá)的作用最明顯，但不影響PPARγser273磷酸化水平(P＞0.05）;在400μmol/L時(shí)PPARγ蛋白未發(fā)生改變(P＞0.05)，卻可上調(diào)PPARγser273磷酸化水平(P＜0.01）。不同濃度油酸對(duì)CDK5mRNA及蛋白均無明顯調(diào)節(jié)作用(P＞0.05;P＞0.05)。
　　3.適宜濃度（100μmol/L）油酸在上調(diào)脂聯(lián)素的同時(shí)上調(diào)PP

8、ARγmRNA及蛋白表達(dá)(P＜0.01;P＜0.01)，加入PPARγ抑制劑后，油酸對(duì)脂聯(lián)素的上調(diào)作用受到抑制，脂聯(lián)素mRNA及蛋白顯著下降，甚至低于對(duì)照組(P＜0.01;P＜0.05)。
　　4.高濃度(400μmol/L)油酸在下調(diào)脂聯(lián)素的同時(shí)上調(diào)PPARγser273磷酸化水平(P＜0.01;P＜0.01)，并上調(diào)p-CDK5磷酸化水平(P＜0.05)，加入CDK5活性抑制劑后，p-CDK5磷酸化水平下降(P＜0.05)，P

9、PARγser273磷酸化水平下降至對(duì)照組水平(P＞0.05），同時(shí)脂聯(lián)素mRNA及蛋白回升至對(duì)照組水平(P＞0.05;P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.油酸對(duì)脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用隨濃度而不同，在50、100、200μmol/L時(shí)可上調(diào)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，在50、100μmol/L使可上調(diào)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)，400μmol/L時(shí)可抑制脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)。
　　2.適宜濃度（100μmol/L）油酸可通過上調(diào)PPARγ