克雷伯氏桿菌噬菌體的生物學(xué)特性及其抗性菌株的選育.pdf

1、克雷伯氏桿菌是微生物法發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的重要生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)過程中若發(fā)生噬菌體感染，將影響細(xì)胞生長和代謝，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中感染噬菌體的報道主要集中在乳制品工業(yè)以及少數(shù)的大宗化學(xué)品產(chǎn)業(yè)，1，3-丙二醇發(fā)酵生產(chǎn)過程中噬菌體的信息比較有限，國內(nèi)尚處空白。鑒于上述情況，本論文分離出造成發(fā)酵異常的克雷伯氏桿菌的噬菌體，考察其生物學(xué)特性及其對發(fā)酵代謝的影響，對防治噬菌體污染進(jìn)行了初步的探索，并篩選了抗噬菌體的菌

2、株。
　　首先，對克雷伯氏桿菌的噬菌體進(jìn)行了鑒定、分離和分類。以絲裂霉素C誘導(dǎo)法鑒定產(chǎn)生異常發(fā)酵的生產(chǎn)菌株溶源性噬菌體，采用敏感指示菌法及Adams雙層平板法從引起發(fā)酵異常的克雷伯氏桿菌中分離純化出一株溶源性噬菌體。通過氯仿敏感性實驗測定顯示，該噬菌體對氯仿不敏感，從而表明該噬菌體無包膜，其衣殼內(nèi)不含脂類物質(zhì)。用磷鎢酸負(fù)染法透射電鏡觀察，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行分類，屬于有尾噬菌體目，長尾噬菌體科。手工法提取噬菌體核酸，限制性內(nèi)切酶EcoR

3、Ⅰ和HindⅢ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，表明該噬菌體的核酸為dsDNA。根據(jù)酶切圖譜估算的噬菌體基因組大小約為42 kb。
　　其次，測定了噬菌體的生物學(xué)特性，其最佳感染復(fù)數(shù)為1;一步生長曲線顯示，噬菌體的潛伏期與裂解期均為50 min，裂解量為343個。還考察了溫度、pH、紫外線等理化因素對噬菌體活性的影響。該噬菌體對溫度比較敏感，其最適溫度為37℃，經(jīng)70℃處理30 min即完全失活。其存活的pH范圍較寬，對酸堿均有一定的

4、抗性，在pH7-8范圍內(nèi)效價最高，較耐堿性，在偏酸性條件下(pH＜4)效價降低速率較快。該噬菌體對紫外線照射非常敏感，照射3 min活性即下降90％以上，照射時間達(dá)12 min之后基本完全失活。
　　再次，考察了噬菌體對克雷伯氏桿菌生長和發(fā)酵代謝的影響。結(jié)果顯示，與正?？死撞蠗U菌相比，感染噬菌體的宿主細(xì)胞生長停滯期約8h，最高菌體濃度下降了33％。比較兩種情況下的主要代謝產(chǎn)物生成情況，其主產(chǎn)物1，3-丙二醇產(chǎn)量下降38％，代謝流

5、偏向了乳酸等有機酸途徑。為探索針對噬菌體污染的防治措施，考察了Ca2+、三種不同濃度的表面活性劑以及不同濃度的氨芐青霉素對降低噬菌體影響菌體生長的作用，結(jié)果顯示所考察的三種方法條件對噬菌體均無有效的抑制作用。
　　最后，篩選抗性菌株。通過高濃度噬菌體侵染條件下的自發(fā)突變經(jīng)初篩、復(fù)篩得到一株抗性菌株。發(fā)酵驗證顯示，該菌株菌體生長未出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，表現(xiàn)出了一定的抗性。但代謝流仍然偏向乳酸等有機酸途徑，導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量偏低。進(jìn)一步采