德氏乳桿菌抗噬菌體菌株的篩選及抗性機(jī)理研究.pdf

1、德氏乳桿菌作為乳制品發(fā)酵中的重要菌株，在酸奶發(fā)酵中主要負(fù)責(zé)產(chǎn)酸、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、改善質(zhì)地等。但是乳桿菌噬菌體的存在給發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響，給生產(chǎn)者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了有效的防止乳桿菌噬菌體的污染和為我國(guó)抗噬菌體發(fā)酵劑的研究工作提供理論依據(jù)，本文以德氏乳桿菌和德氏乳桿菌噬菌體phildb為研究對(duì)象展開研究。
　　 噬菌體誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞裂解導(dǎo)致發(fā)酵失敗或緩慢，使產(chǎn)酸和乳制品質(zhì)下降產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)損失，因而引起了對(duì)乳品生物技術(shù)

2、和噬菌體生物學(xué)研究并且提出了許多防治噬菌體污染的措施，其中選育抗噬菌體菌株就是一種有效的方法。噬菌體抗性菌株通常是通過(guò)DNA重組或攜帶噬菌體抗性基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移獲得的，因而賦予所得菌株潛在的安全隱患。而自發(fā)突變的方法，由于不涉及基因操作，已被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便有效且天然的獲得抗噬菌體菌株的方法。本論文利用L.bulgaricus KLDS1.1016和L.bulgaricus KLDS1.1028為宿主菌，采用次級(jí)感染的方法篩選自發(fā)突變的抗

3、噬菌體菌株，將篩選出的有抗性的7株L.bulgaricus KLDS1.1028抗噬菌體菌株和10株L.bulgaricus KLDS1.1016抗噬菌體菌株進(jìn)行RAPD-PCR鑒定，然后進(jìn)行EOP、遺傳穩(wěn)定性、溶源性檢測(cè)等抗性檢測(cè)，并對(duì)其中的兩株抗性菌BIM02、BIM8及野生株進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定。結(jié)果顯示所篩選的抗性株菌和對(duì)應(yīng)的野生菌的RAPD-PCR電泳圖譜一致，經(jīng)過(guò)聚類分析其相似系數(shù)都達(dá)到80％以上。并進(jìn)一步證明所有抗性菌均來(lái)自對(duì)

4、應(yīng)的野生菌，而非雜菌污染。抗性菌株與噬菌體雙層培養(yǎng)均無(wú)噬菌斑出現(xiàn)，幾乎表現(xiàn)出完全抗性。穩(wěn)定性及溶源性檢測(cè)表明均是遺傳性穩(wěn)定的非溶源性菌。無(wú)論噬菌體是否存在，兩株抗性菌BIM02、BIM8其發(fā)酵活菌數(shù)、產(chǎn)酸能力都與野生菌相似，且制作的發(fā)酵乳黏度也與野生菌株無(wú)明顯差別，適于作為酸奶發(fā)酵菌株。
　　 所篩選的17株德氏乳桿菌抗噬菌體菌株經(jīng)過(guò)噬菌體吸附試驗(yàn)，表明抗性菌對(duì)噬菌體的吸附率明顯下降，這說(shuō)明突變株的突變可能發(fā)生在噬菌體的吸附受體

5、上從而干擾了噬菌體的吸附。并且經(jīng)過(guò)提取細(xì)胞壁分析受體成分表明噬菌體phildb的吸附受體與德氏乳桿菌細(xì)胞壁上與肽聚糖相連的多糖聚合物有關(guān)。
　　 通過(guò)PCR等方法對(duì)2株野生德氏乳桿菌和17株相應(yīng)的抗噬菌體菌株進(jìn)行CRISPR序列的擴(kuò)增和測(cè)序，均檢測(cè)到CRISPR序列的存在，但經(jīng)鑒定其抗性均非CRISPR中插入spacer序列而引起的。進(jìn)一步研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌中存在R-M系統(tǒng)，并擴(kuò)增獲得L.bulgaricusKLDS1.10

6、28和L.bulgaricus KLDS1.1016中的Ⅰ型R-M系統(tǒng)。對(duì)組成Ⅰ型R-M系統(tǒng)的三個(gè)亞基HsdS、HsdM、HsdR測(cè)序并與在GenBank中報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)菌株的Ⅰ型R-M系統(tǒng)的亞基進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)其相似系數(shù)HsdM達(dá)95％以上和HsdR為85％左右。
　　 本課題結(jié)論:篩選出具有抗噬菌體的德氏乳桿菌菌株經(jīng)測(cè)定其發(fā)酵性能良好，適于作為酸奶發(fā)酵菌株。進(jìn)一步研究其抗性機(jī)理發(fā)現(xiàn)抗性菌株噬菌體吸附率明顯下降，噬菌體受體與德氏乳桿菌

7、細(xì)胞壁上與肽聚糖相連的多糖聚合物有關(guān)。并檢測(cè)出新的噬菌體防御系統(tǒng)CRISPR，但此系統(tǒng)并未產(chǎn)生抗性作用。在德氏乳桿菌中檢測(cè)到的Ⅰ型R-M抗性機(jī)制的存在。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 (1)成功選育出抗噬菌體的L.bulgaricus KLDS BIM02和L.bulgaricus KLDS BIM8菌株并確定其有良好的發(fā)酵特性，為今后抗噬菌體菌株的開發(fā)奠定基礎(chǔ)
　　 (2)確定德氏乳桿菌噬菌體phildb的受體和與肽聚