新型無(wú)機(jī)納米載體的構(gòu)建及其藥物-基因的高效傳遞研究.pdf

1、納米載體在藥物/基因傳遞中具有特殊的價(jià)值和意義。納米載體粒徑大小在10～500 nm，可將藥物分子包裹其中或吸附在其表面，通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向藥物輸送和基因治療。無(wú)機(jī)納米粒載體因具有生物安全、高效、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來(lái)新型藥物/基因傳遞系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)。本論文重點(diǎn)圍繞新型無(wú)機(jī)納米粒載體的構(gòu)建及其在藥物/基因傳遞中的應(yīng)用開(kāi)展研究，主要分為四個(gè)部分：
　　 第一部分納

2、米載體在藥物/基因傳遞中的應(yīng)用研究進(jìn)展
　　 對(duì)納米藥物載體及基因載體的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，主要內(nèi)容包括：納米載體的特點(diǎn)及制備新技術(shù)、納米藥物緩控釋系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)、基因載體的分類(lèi)與特點(diǎn)、非病毒納米基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)、新型納米載體在藥物/基因傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)展、基于組織工程的三維支架以及軟骨種子細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化研究進(jìn)展等。文獻(xiàn)綜述為論文后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分新型多孔二氧化硅納米粒在藥物傳遞中的

3、應(yīng)用研究
　　 以生物安全的硅膠為載體材料，運(yùn)用納米技術(shù)，自行研制出具有高效增溶、長(zhǎng)效緩釋作用的新型多孔二氧化硅納米粒(Porous silica nanoparticles，PSNs)。分別選擇水溶性藥物水飛薊賓葡甲銨(Silybin meglumine，SLBM和難溶性藥物水飛薊賓(Silybin，SLB)為模型藥物，研究PSNs新載體在水溶性藥物和難溶性藥物72h高效長(zhǎng)效制劑開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用可能，為3天給藥1次的高效長(zhǎng)效新制劑

4、開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。
　　 1.水溶性藥物72h高效長(zhǎng)效新制劑的研制：以水溶性藥物水飛薊賓葡甲銨)為模型藥物，PSNs為載體，制備了水飛薊賓葡甲銨72h高效長(zhǎng)效制劑(3d-SLBM)。體外評(píng)價(jià)研究結(jié)果表明：3d-SLBM的主藥含量為29.46 mg/50mg，載藥量為58.91±0.39％，包封率為58.43±0.62％；體外釋藥特性研究結(jié)果顯示，3d-sLBM中SLBM的釋放適宜在低濃度的碳酸鈉溶液中進(jìn)行，72 h累積釋放大于8

5、0％；體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示；比格犬口服3d-SLBM，高效液相法測(cè)定犬體內(nèi)血藥濃度，3d-SLBM的Tmax24 h與參比制劑Tmax0.5 h相比大大增加，3d-SLBM的MRT38.89 h與參比制劑的MRT7.31 h相比顯著延長(zhǎng)，顯示出長(zhǎng)效緩釋特征；3d-SLBM中游離藥物的相對(duì)生物利用度達(dá)到803.99％：體外溶出結(jié)果與體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性，體外溶出結(jié)果可以間接反映其體內(nèi)質(zhì)量；藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3d-SLBM組小鼠血漿中

6、AST(291.83±76.03 TU/L)和ALT(774.92±223.85 IU/L)值明顯低于CCl4對(duì)照組(AST：901.00±174.32 IU/L，ALT：1997.58±335.08 IU/L)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明3d-SLBM的生物利用度高、保肝效果好。
　　 2.難溶性藥物72h高效長(zhǎng)效新制劑的研制：以難溶性藥物水飛薊賓為模型藥物，綜合運(yùn)用固體分散速釋技術(shù)、親水凝膠骨架緩釋技術(shù)和PSNs長(zhǎng)

7、效緩釋技術(shù)制備了水飛薊賓72h高效長(zhǎng)效制劑(3d-SLB)。體外評(píng)價(jià)研究結(jié)果表明：3d-SLB中SLB的釋放適宜在低濃度的碳酸鈉溶液中進(jìn)行，72 h累積釋放大于80％；體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示：比格犬口服3d-SLB，高效液相法測(cè)定犬體內(nèi)血藥濃度，3d-SLB的Tmax24h與參比制劑Tmax1h相比大大增加，3d-SLB的MRT32.15 h與參比制劑的MRT6.11 h相比顯著延長(zhǎng)，顯示出長(zhǎng)效緩釋特征；3d-SLB中游離藥物的相對(duì)生物

8、利用度達(dá)到458.98％，體外溶出結(jié)果與體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性，體外溶出結(jié)果可以間接反映其體內(nèi)質(zhì)量；藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3d-SLB小鼠血漿中AST(149.90±28.14 IU/L)和ALT(843.33±169.18 IU/L)值明顯低于CCl4對(duì)照組(AST：901.00±174.32 IU/L，ALT：1997.58±335.08 IU/L)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明3d-SLB生物利用度高、保肝性能優(yōu)越。

9、　　 第三部分載基因納米粒的制備及其在基因傳遞中的應(yīng)用研究
　　 選擇生物安全的磷酸鈣納米粒(Calcium phosphate nanoparticles，CPNPs)和PSNs，制備載基因DNA-CPNPs和DNA-PSNs；通過(guò)對(duì)載基因納米粒進(jìn)行修飾，成功制備了多糖修飾的DNA-CPNPs和鈣離子化DNA-PSNs；著重研究了DNA-CPNPs、多糖修飾的DNA-CPNPs、鈣離子化DNA-PSNs3種新型載基因納米粒對(duì)

10、干細(xì)胞的傳遞效果。
　　 1.DNA-磷酸鈣納米粒的制備及其干細(xì)胞的傳遞研究：用反相微乳法制備了DNA-CPNPs，對(duì)其進(jìn)行表征，并將其應(yīng)用于干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。研究結(jié)果表明：DNA-CPNPs的粒徑為20-50 nm；瓊脂糖電泳結(jié)果表明：磷酸鈣：質(zhì)粒質(zhì)量比為2:1時(shí)，CPNPs攜帶質(zhì)粒量最大，可有效阻滯DNA的遷移；活細(xì)胞工作站測(cè)定結(jié)果顯示：游離DNA因沒(méi)有納米粒載體的作用，細(xì)胞未顯紅色，說(shuō)明游離DNA未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而DNA-CPN

11、Ps2h開(kāi)始有少數(shù)細(xì)胞顯紅色，隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的外源基因進(jìn)入細(xì)胞，說(shuō)明納米?？捎行y帶基因進(jìn)入細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡觀察核轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果顯示：2 h未見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)顯紅色，說(shuō)明DNA-CPNPs此時(shí)尚未進(jìn)入細(xì)胞核，4 h進(jìn)核亦不明顯，8 h有少量進(jìn)核，18h可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)呈明顯的紅色，表明此時(shí)外源DNA在納米粒作用下進(jìn)核明顯；活細(xì)胞工作站和共聚焦顯微鏡測(cè)定結(jié)果均顯示納米粒可被干細(xì)胞吞噬。MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示：DNA-CPNPs的毒

12、性明顯低于市售轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(P<0.01)；ELISA測(cè)定結(jié)果表明，DNA-CPNPs在干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000相當(dāng)(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：DNA-CPNPs轉(zhuǎn)染效率高、毒性低，可以作為一種生物安全的非病毒基因載體。
　　 2.多糖修飾的DNA-磷酸鈣納米粒的制備及其干細(xì)胞的傳遞研究：選擇DNA-CPNPs，通過(guò)對(duì)載基因納米粒進(jìn)行修飾，成功制備了多糖

13、修飾的DNA-CPNPs，初步研究了多糖修飾的DNA-CPNPs在干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。透射電鏡測(cè)定結(jié)果表明：多糖修飾的DNA-CPNPs呈球型、粒徑分布穩(wěn)定、分散均一，粒徑在50nm左右；ELISA測(cè)定結(jié)果表明：與市售脂質(zhì)體lipofectamine2000相比，多糖修飾的DNA-CPNPs在干細(xì)胞中具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.鈣離子化DNA-多孔二氧化硅納米粒的制備及其性能評(píng)價(jià)：選擇PSNs為載體，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行修飾，成功制

14、備了鈣離子化DNA-PSNs，初步研究了鈣離子化DNA-PSNs在干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。瓊脂糖電泳結(jié)果表明：鈣離子化的PSNs能夠與質(zhì)粒DNA較好的結(jié)合，阻滯其電泳遷移，而未修飾的PSNs與DNA結(jié)合能力弱，不能有效阻滯DNA遷移；EDS能譜分析結(jié)果表明：鈣離子有效結(jié)合到PSNs上；倒置熒光顯微結(jié)果表明：與DNA-PSNs相比，鈣離子化DNA-PSNs能夠轉(zhuǎn)染更多的細(xì)胞，說(shuō)明鈣離子化DNA-PSNs可以作為一種有效的非病毒基因載體。
　

15、　 第四部分三維納米基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及其在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用研究
　　 將細(xì)胞外基質(zhì)修飾納米粒技術(shù)與基于組織工程的三維支架技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建非病毒三維納米基因傳遞系統(tǒng)。以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分為支架材料，制備嵌合有DNA-CPNPs的三維支架，成功構(gòu)建了兼具高效、緩釋特征的非病毒三維納米基因傳遞系統(tǒng)(3 dimensional nanoparticles gene delivery system，3D-NGDS)。

16、>　　 1.三維納米基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及其性能評(píng)價(jià)：以細(xì)胞外基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇對(duì)干細(xì)胞黏附及增殖效果好的纖維粘結(jié)蛋白、膠原為支架材料，制備膠原/FN/殼聚糖三維支架；在此基礎(chǔ)上，采用冷凍干燥法制備嵌合DNA-CPNPs的三維納米基因傳遞系統(tǒng)(3D-NGDS)，并觀測(cè)其孔徑、孔隙率、吸水率、保水率，結(jié)果表明：3D-NGDS中存在較大孔徑(≥100μm)的孔道，吸水率和保水率與支架材料的配比有關(guān)。研究結(jié)果表明：3D-NGDS多孔、生

17、物安全，適宜干細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　 2.三維納米基因傳遞系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究：以碘化丙啶標(biāo)記基因，通過(guò)活細(xì)胞工作站觀測(cè)，結(jié)合免疫組化的方法，對(duì)3D-NGDS中基因的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了研究；運(yùn)用Picogreen Dye法測(cè)定不同支架不同時(shí)間培養(yǎng)液中DNA的含量，繪制DNA累積釋放曲線，結(jié)果顯示3D-NGDS中DNA累積釋放率3d達(dá)到33.4％，21d達(dá)到69.7％；而游離DNA-三維支架3d DNA累積釋放率達(dá)到87.7％，3D-NGD

18、S對(duì)DNA具有良好的緩釋作用。ELISA法測(cè)定二維體系及3D-NGDS3-15天細(xì)胞表達(dá)的TGF-β1濃度，結(jié)果表明：3D-NGDS在3-15天內(nèi)，蛋白表達(dá)水平維持在10 ng/ml左右，其中第6天表達(dá)濃度達(dá)到12.6 ng/ml，顯著高于二維轉(zhuǎn)染體系(P<0.01)，達(dá)到了外加TGF-β1因子有效濃度，顯示出明顯的高效特征。通過(guò)觀測(cè)干細(xì)胞在二維及3D-NGDS中轉(zhuǎn)染15天的甲苯胺藍(lán)(GAG)染色圖及Ⅱ型膠原免疫組化染色圖，結(jié)果表明：二