聚乙酰亞胺載體介導的高效基因傳遞方法.pdf

1、背景和目的：轉基因技術已廣泛應用于生物醫(yī)學基礎研究和臨床治療領域。目前此技術包括使用病毒載體和非病毒載體兩類方法。病毒載體的優(yōu)點在于感染效率高，而缺點是具有免疫原性和致癌性，因此在臨床應用上受到限制。非病毒載體主要包括脂質體和陽離子聚合物載體，脂質體使用時間長，發(fā)展成熟轉染效率高，但是其毒性較大，特別是在體內應用時更甚。陽離子聚合物是一種新型非病毒載體，雖使用時間較短，但高效、低毒、低免疫原性和價廉的優(yōu)點使其倍受關注。而聚乙酰亞胺屬于陽

2、離子聚合物，同樣具備此類載體的特征，因而已獲得廣泛的應用，并且推廣至臨床的基因治療?？墒?，相對于經典的脂質體轉染方法，polyethylenimine（PEI）存在著轉染效率低、重復性差的明顯缺點，以致于PEI的應用受限。于是，本研究在對影響PEI轉染的各項因素進行優(yōu)化的基礎上，提出了一套操作方便、轉染效果好的改良程序，以實現(xiàn)以下目標：（1）建立基于PEI轉染的高效制備亞病毒載體的方法；（2）通過平板離心技術提高PEI轉染細胞的效率和慢

3、病毒感染細胞的效率；（3）建立一套快速檢測細胞GFP表達水平從而檢測轉染效率的方法。
　　方法：（1）對PEI轉染293T細胞的各項可能的影響因素進行優(yōu)化處理，綜合提出一套高效制備慢病毒/逆轉錄病毒的方案；（2）利用平板離心技術研究合適的離心強度和轉染對細胞毒性的影響。在慢病毒感染細胞的過程中，對細胞進行平板離心的不同處理，研究離心時間和轉速對于細胞內病毒載體的 RNA、DNA、蛋白水平的影響，調查離心對細胞轉染的可能作用。（3）

4、利用多功能酶標儀檢測GFP，與常見檢測GFP的方法進行對比，建立一套基于多功能酶標儀的高效檢測GFP的方法。
　　結果：本課題研究（1）通過對PEI轉染293T細胞影響因素的優(yōu)化，提出了一套優(yōu)化的轉染293T細胞制備亞病毒載體的方法；（2）通過平板離心技術，大大提升了PEI轉染細胞和慢病毒感染細胞的效率，并發(fā)現(xiàn)離心增加轉染效率和感染效率都是通過改變轉染復合物或者病毒的空間分布所致；（3）基于多功能酶標儀，建立了一套檢測GFP的方法