新型高效重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其在肺癌基因治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分FKBP52對羥基脲處理的重組腺相關(guān)病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響 酪氨酸磷酸化的細(xì)胞蛋白FKBP52抑制重組腺相關(guān)病毒DNA的第二鏈合成，從而抑制基因表達(dá)。為進一部探討FKBP52對AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的作用，我們建立了野生型(WT)FKBP52、雜合型(HE)及FKBP52基因敲除(KO)鼠胚纖維母細(xì)胞系(MEFs)。傳統(tǒng)的單鏈AAV不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型FKBP52鼠胚纖維母細(xì)胞(WTMEFs)，在雜合型及FKBP5

2、2基因敲除鼠胚纖維母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也未見顯著增加。在這些細(xì)胞中，AAV不能有效地轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核。羥基脲(HU)處理后能使AAV在WTMEFs中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高25倍，但是在KOMEFs中AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率僅提高4倍。為避免AAV第二鏈合成的影響，進一步采用自身互補的AAV載體進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HU能使WTMEFsAAV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增強23倍，但在KOMEFs中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率僅增加4倍。提示，HU處理后KOMEFs中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率未增加的原因并非由于AA

3、V第二鏈的合成障礙所致。HU處理后，59﹪的AAV基因組DNA出現(xiàn)在WTMEFs細(xì)胞核，KOMEFs細(xì)胞核中為28﹪，提示HU介導(dǎo)的AAV轉(zhuǎn)運通路在KOMEFs中存在缺陷。當(dāng)KOMEFs轉(zhuǎn)染FKBP52表達(dá)質(zhì)粒后，HU處理所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率恢復(fù)至WTMEFs的水平，且直接與其轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運功能改善相吻合。本研究提示：作為一種細(xì)胞分子伴侶蛋白，F(xiàn)KBP52能促進AAV在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，有益于重組AAV載體在人類基因治療中的應(yīng)用。

4、 第二部分自身互補腺相關(guān)病毒載體：包裝容量及其純度重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)已應(yīng)用于Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗。然而，由于AAV為單鏈DNA，因此影響AAV載體介導(dǎo)的基因表達(dá)。自身互補AAV(scAAV)載體，由于其含有雙鏈DNA，因此越過了第二鏈合成的障礙，使AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著提高。根據(jù)AAV的生物學(xué)特性，目前認(rèn)為scAAV的包裝容量是傳統(tǒng)單鏈AAV的包裝容量(4.8kb)的一半。為明確scAAV的確切包裝容量，本研究構(gòu)建了含人

5、綠色熒光蛋白(hrGFP)的scAAV質(zhì)粒，長度為2.3-4.1kb。出乎意料，這些不同大小的基因均能被包裝為滴度相似的成熟病毒顆粒。然而，在293細(xì)胞，特別是Hela細(xì)胞中，小于或等于3.3kb的病毒載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于3.5kb及3.5kb以上基因長度的病毒載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。以中性膠及堿性膠分析病毒DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小于等于3.3kb的病毒DNA中，45﹪的病毒為雙鏈，55﹪的病毒DNA為單鏈，3.5kb及大于3.5kb僅被

6、包裝為單鏈。研究結(jié)果顯示，scAAV的最大包裝容量為3.3kb。 本研究進一步探討了單鏈病毒的產(chǎn)生機制。當(dāng)AAV拯救和復(fù)制后，以MscI消化，結(jié)果證實位于AAV一端反向末端重復(fù)單位中的trs并未修復(fù)。單鏈AAV的產(chǎn)生至少部分是因為AAVHelp質(zhì)粒中包含的Rep基因中的AGT起始編碼，AGT起始編碼可使Rep蛋白高表達(dá)。此外，隱藏在AAV基因組中類似“trs”的基序可導(dǎo)致單鏈DNA的產(chǎn)生。本研究證實大于目前普遍認(rèn)為的包裝長度的基

7、因能成功地包裝為scAAV，但是必須使用恰當(dāng)?shù)腁AV輔助質(zhì)粒，從而減少單鏈AAV、產(chǎn)生更高純度的scAAV，提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 第三部分腺相關(guān)病毒2/5載體攜帶CD40配體轉(zhuǎn)導(dǎo)人肺癌細(xì)胞及其對樹突狀細(xì)胞的作用研究基因治療開創(chuàng)了肺癌治療的新途徑。通過基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)介導(dǎo)目的基因的表達(dá)，可誘導(dǎo)持久的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。通過刺激樹突狀細(xì)胞(DCs)表面CD40(CD40)，可誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生強大的腫瘤免疫治療作用。

8、 本實驗我們研究了不同rAAV(recombinantAAV，rAAV)血清型載體在肺癌A549細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并與自身互補AAV(scAAV)相比較。此外，進一步研究了常用肺癌化療藥物卡鉑對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響以及轉(zhuǎn)導(dǎo)CD40L的腫瘤細(xì)胞對DCs的刺激作用。采用流式細(xì)胞術(shù)測定rAAV-GFP及rAAV-CD40L感染肺癌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，轉(zhuǎn)導(dǎo)CD40L的肺癌細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)后，ELISA測定培養(yǎng)上清中IL-12水平。結(jié)果提示，重組腺相