新型納米復(fù)合載體的構(gòu)建及其介導(dǎo)NK4基因在治療乳腺癌中的應(yīng)用.pdf

1、前言
　　 隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究的深入和應(yīng)用,基因治療逐漸成為腫瘤生物治療學(xué)中的重要組成部分,在乳腺癌的治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。目前,乳腺癌基因治療尚存在一些問(wèn)題,首先,用于研究和應(yīng)用臨床的基因轉(zhuǎn)染方法有多種,但轉(zhuǎn)染效果仍不令人滿意。例如,逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染率較高且表達(dá)穩(wěn)定,但它僅對(duì)增殖活躍的細(xì)胞才有較高的轉(zhuǎn)染率,且在轉(zhuǎn)染過(guò)程中可整合到宿主細(xì)胞而發(fā)生插入型突變和癌基因激活,不適于介導(dǎo)人體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)移。腺病毒所攜帶的基因雖具有較

2、高的轉(zhuǎn)染率但不能整合到宿主細(xì)胞的染色體上,不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。而且,乳腺癌基因治療缺乏特異性和高效性載體,若僅部分腫瘤細(xì)胞被導(dǎo)入基因,治療效果會(huì)受到影響,而載體特異性差則會(huì)導(dǎo)致癌旁組織及骨髓等其他重要組織被累及。因此,加強(qiáng)基因治療的靶向性、安全性,開發(fā)出高效的新載體系統(tǒng)已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 陽(yáng)離子高分子聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)因其能有效濃縮DNA分子形成穩(wěn)定

3、的納米粒子,保護(hù)DNA分子的生物活性、避免酶解、并能被細(xì)胞有效內(nèi)吞,從而在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA分子的解離釋放和表達(dá),已成為非病毒陽(yáng)離子聚合物載體中最成功的例子,是設(shè)計(jì)新的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染載體的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前研究主要從降低細(xì)胞毒性,提高轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞靶向性等方面對(duì)PEI進(jìn)行改造。最吸引人的策略之一是利用受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用來(lái)替代PEI和細(xì)胞間的非特異靜電作用,這種主動(dòng)的靶向需要使用高親和性和特異性的配體識(shí)別結(jié)合部位的靶細(xì)胞表面的受體。透明質(zhì)酸(

4、hyaluronic acid,HA),作為抗腫瘤藥物的靶向載體,能夠?qū)⑤^小的藥物分子黏附在它的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中或者將藥物分子接枝到透明質(zhì)酸類藥物的載體上,所形成的粒子或復(fù)合物與腫瘤細(xì)胞表面的受體靶向結(jié)合,使更多的藥物分子進(jìn)入腫瘤組織,增加抗腫瘤藥在腫瘤和淋巴結(jié)中的吸收和滯留時(shí)間,從而提高藥物的療效,降低毒副作用。本實(shí)驗(yàn)將HA作為靶向配體修飾PEI/DNA復(fù)合物,構(gòu)建HA/PEI/DNA三元納米復(fù)合物,并對(duì)其進(jìn)行表征和性能檢測(cè)。
　　

5、 由于乳腺癌的基因治療缺乏更為有效的目的基因,NK4作為HGF的拮抗劑,具有血管新生抑制和癌浸潤(rùn)抑制兩大作用,這種雙重作用在裸鼠乳腺癌移植試驗(yàn)上已獲得了證實(shí),即提示它可成為具備這兩大功能的嶄新抗癌藥。因此本實(shí)驗(yàn)采用NK4為目的基因,首次構(gòu)建HA/PEI/PCAGGS-NK4納米復(fù)合物,考察其在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用,并建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,觀察三元復(fù)合物HA/PEI/PCAGGS-NK4在體內(nèi)的抑瘤效果。
　　 實(shí)驗(yàn)方法

6、r>　　 一、HA/PEI/DNA三元納米復(fù)合物的構(gòu)建及性能檢測(cè)
　　 1、HA/PEI/DNA三元復(fù)合物的構(gòu)建與表征
　　 制備不同HA與PEI負(fù)正電荷摩爾比的。HA/PEI/DNA三元復(fù)合物,瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),馬爾文粒度分析儀檢測(cè)納米粒的粒徑分布及Zeta電位,比較其在水及BSA中的粒徑變化。
　　 2、HA/PEI/DNA三元復(fù)合物的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　 取乳腺癌細(xì)胞MDA-

7、MB-231,MCF-7,MDA-MB-435,轉(zhuǎn)染一定量上述不同電荷比的納米復(fù)合物,在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。
　　 3、乳腺癌細(xì)胞系CD44表達(dá)水平
　　 三種乳腺癌細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清,細(xì)胞抽提物總蛋白采用BCA蛋白分析試劑盒定量。SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜,加CD44s單克隆抗體孵育后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗,顯色,以β-actin為內(nèi)標(biāo)。
　　 4、三元復(fù)合物對(duì)COS

8、-1細(xì)胞的毒性試驗(yàn)
　　 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-1細(xì)胞,加入不同濃度的不同HA與PEI電荷比的三元復(fù)合物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加MTT液振搖,孵育4h后加入DMSO,裂解細(xì)胞,混勻,選擇570nm波長(zhǎng),用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值。
　　 二、HA/PEI/PCAGGS-NK4納米復(fù)合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的研究
　　 1、HA/PEI/PCAGGS-NK4納米粒的制備與表征
　　 制備納米粒HA/PEI/PCAG

9、GS-NK4與HA/PEI/PCAGGS-LacZ,進(jìn)行DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),測(cè)定粒徑和Zeta電位,方法均同上述三元復(fù)合物的構(gòu)建與表征方法。
　　 2、Western-blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞NK4蛋白的表達(dá)
　　 MDA-MB-231,MDA-MB-435,MCF-7細(xì)胞,加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋含100μg/ml PCAGGS-NK4質(zhì)粒的納米復(fù)合物,4h后加入含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),回收各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,刮取細(xì)胞裂

10、解物,進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白條帶,轉(zhuǎn)膜后,加入NK4一抗(人HGF單抗)孵育,再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,β-actin做對(duì)照。
　　 3、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力
　　 三種乳腺癌細(xì)胞過(guò)夜貼壁后,換液加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度HA/PEI/PCAGGS-NK4與HA/PEI/PCAGGS-LacZ納米復(fù)合物,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較各組細(xì)胞的增殖能力。
　　 4、Transwell法測(cè)定癌細(xì)胞侵襲能

11、力
　　 細(xì)胞貼壁后換液加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的含不同濃度PCAGGS-LacZ,PCAGGS-NK4質(zhì)粒的納米復(fù)合物,12h后用胰酶消化,接種于Transwell小室的上室,其下室中加入含10％新生小牛血清的培養(yǎng)液,12h后取出小室,固定,染色,高倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。
　　 5、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率
　　 將被染色分析的細(xì)胞用冷PBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液中重懸。吸取100ul的

12、細(xì)胞(1×105)至試管中。加入適量的熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ試劑和PI,混勻后避光室溫下孵育15min后加入400ul染色緩沖液,立即上流式細(xì)胞儀分析。取少量滴片,置熒光鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài),計(jì)算凋亡、壞死百分率。
　　 三、HA/PEI/PCAGGS-NK4對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的考察
　　 1、建立人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型與給藥
　　 BALB/c(nu/nu)裸鼠30只,每只接種0.2ml(1×1

13、07/ml MDA-MB-231)細(xì)胞于裸鼠右側(cè)胸壁第二乳頭下脂肪墊內(nèi)。8d后,隨機(jī)分為3組,每組10只,分別命名為:(1)對(duì)照組,即HA/PEI/PCAGGS-LacZ注射組(腫瘤及腫瘤周圍多點(diǎn)注射200 μl質(zhì)粒溶液,含100μg PCAGGS-LacZ)；(2)給藥組,即HA/PEUPCAGGS-NK4注射組(腫瘤及腫瘤周圍多點(diǎn)注射200 μl質(zhì)粒溶液,含100μg PCAGGS-NK4)；(3)陽(yáng)性對(duì)照組,即阿霉素組,0.2ml

14、(含阿霉素100μg)腹腔注射,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,抑瘤率=(1-處理組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100％。
　　 2、Western blot檢測(cè)移植瘤細(xì)胞NK4蛋白的表達(dá)
　　 稱取于液氮中保存的組織0.2g,以預(yù)冷的PBS洗3次并用眼科剪將組織剪碎,在10倍于其體積的裂解緩沖液中迅速攪成勻漿,4℃離心10min,吸出上清液為細(xì)胞總蛋白,用Bradford法測(cè)蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,再用含5％脫脂奶粉

15、的TBST液封閉,然后加入一抗、二抗孵育,用ECL發(fā)光法檢測(cè)不同樣品NK4蛋白表達(dá)狀況。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用one-way ANOVA分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié) 論
　　 1、所構(gòu)建的HA/PEI/DNA能有效結(jié)合DNA分子,在BSA中不會(huì)引起聚集。HA的加入使納米復(fù)合物在

16、三種乳腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率均有增加,在MDA-MB-231,MDA-MB-435(高CD44S表達(dá)的)兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染率明顯升高,產(chǎn)生了細(xì)胞靶向性,當(dāng)HA與PEI電荷比為7.5％時(shí),HA/PEI/DNA在三種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率最高。三元復(fù)合物對(duì)COS-1細(xì)胞的毒性相對(duì)于PEI/DNA二元復(fù)合物大大降低,幾乎無(wú)毒。
　　 2、HA/PEI/PCAGGS-LacZ及HA/PEUPCAGGS-NK4三元復(fù)合物在BSA中不會(huì)引起聚集,質(zhì)粒的結(jié)

17、構(gòu)并不影響納米粒的粒徑及Zeta電位等物理性質(zhì)。三種乳腺癌細(xì)胞系被HA/PEI/PCAGGS-NK4轉(zhuǎn)染后,表達(dá)了NK4外源蛋白,隨著轉(zhuǎn)染復(fù)合物濃度的增加,細(xì)胞增殖有逐漸受到抑制的趨勢(shì),細(xì)胞的侵襲遷移力均有不同程度的減弱,凋亡百分率均有不同程度的增加。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、成功建立人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素組)和給藥組(HA/PEI/PCAGGS-NK4三元復(fù)合物組)裸鼠瘤體的增長(zhǎng)均