產(chǎn)谷胱甘肽釀酒酵母重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵研究.pdf

1、谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種含有巰基的活性三肽化合物，因其在抗氧化、免疫、解毒等方面具有重要的生理作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床、食品、化妝品中。
　　 微生物發(fā)酵法是GSH生產(chǎn)的主要方法。目前，國(guó)內(nèi)GSH生產(chǎn)工藝落后，發(fā)酵成本較高，其供應(yīng)主要依賴(lài)日本等發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)口。所以，如何降低發(fā)酵成本和提高GSH產(chǎn)量是亟待解決的問(wèn)題。
　　 微生物合成GSH是一個(gè)耗氧和耗能的過(guò)程。在實(shí)際發(fā)酵中，溶氧不足常常會(huì)影響菌體

2、細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而影響GSH的合成。傳統(tǒng)的解決供氧問(wèn)題的辦法是改善設(shè)備的供氧能力、增大通氣量或提高攪拌速度，或者在培養(yǎng)液中加入某些助溶劑，以提高氧氣的溶解度。但是，所有這些方法均受到設(shè)備和能耗的限制，并且會(huì)增加發(fā)酵成本。因此，解決供氧問(wèn)題是提高GSH產(chǎn)量的關(guān)鍵之一。為此，本課題針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究。
　　 首先，以釀酒酵母(S.cerevisiae)2.1554為出發(fā)菌株進(jìn)行了亞硝基胍(NTG)誘變，并采用ZnCl2抗性篩選得到

3、一株GSH高產(chǎn)菌株;然后以這株NTG誘變菌為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變和乙硫氨酸抗性篩選，最終得到一株GSH高產(chǎn)菌株S.cerevisiaeNE101，其GSH產(chǎn)量為84.2mg/L，較出發(fā)菌株提高了21.9％。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)誘變篩選到的S.cerevisiaeNE101菌株進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了最有利于提高GSH產(chǎn)量的發(fā)酵條件。其中，培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g/L、酵母粉8g/L、尿素5g/L、磷酸二氫鉀4.5g/L、硫酸鎂0.75g

4、/L;培養(yǎng)條件為:發(fā)酵溫度為30℃、初始pH設(shè)定為6.5、裝液量為30/250ml和接種量為10％。通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，GSH產(chǎn)量達(dá)到117.8mg/L，較初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高39.9％。
　　 第二，透明顫菌血紅蛋白(VHb)能夠從分子水平上提高含透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）的重組菌對(duì)氧氣的利用能力，能夠在限氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的合成，其應(yīng)用不僅可以降低氧氣及能量的消耗，還不需要附加的設(shè)備投資，可大大降低發(fā)酵成本。因此

5、可以用來(lái)解決GSH發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的供氧問(wèn)題。本研究首次將vgb基因整合到產(chǎn)GSH釀酒酵母基因組中。首先，構(gòu)建了含vgb基因的酵母整合型表達(dá)載體pYM-vgb;其次，將重組載體pYM-vgb通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化整合到S.cerevisiaeNE101基因組中并通過(guò)G418抗性篩選和PCR驗(yàn)證得到含vgb基因的重組菌S.cerevisiae101-V;第三，通過(guò)CO差示光譜法驗(yàn)證表明vgb基因成功表達(dá)出有活性的VHb。最后，對(duì)S.cerevisia

6、e101-V進(jìn)行了不同裝液量時(shí)的搖瓶(250ml)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，在裝液量為30ml時(shí)，溶氧相對(duì)豐富，vgb重組菌的生長(zhǎng)略好于宿主菌，GSH的產(chǎn)量較宿主菌提高了18.4％;而在裝液量為50ml、100ml時(shí)，溶氧會(huì)較為貧乏，此時(shí)重組菌的生長(zhǎng)速率高于宿主菌，并且GSH的產(chǎn)量分別達(dá)到128.7mg/L和115.2mg/L，分別較宿主菌提高29.2％和43.1％。這證明了在限氧條件下vgb基因的表達(dá)有利于促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和GSH的合成。

7、r>　　 第三，利用響應(yīng)面法對(duì)重組菌S.cerevisiae101-V的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cys濃度、酵母粉濃度和MgSO4濃度是影響GSH產(chǎn)量的最主要的因素;然后進(jìn)一步通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到這三個(gè)因素的最佳配比，即Cys濃度為1.13g/L，酵母粉濃度為14.76g/L，MgSO4濃度為1.54g/L時(shí)，此時(shí)GSH的產(chǎn)量達(dá)到最大值170.9mg/L，較原始發(fā)酵條件提

8、高22.5％。
　　 第四，對(duì)產(chǎn)GSH釀酒酵母生產(chǎn)菌株細(xì)胞中的GSH進(jìn)行了初步分離純化研究。首先比較了熱水抽提法和乙醇抽提法提取GSH的效果。乙醇抽提法因其價(jià)廉簡(jiǎn)便、不破壞細(xì)胞的完整性且簡(jiǎn)便了后期純化等優(yōu)點(diǎn)而被確定為本實(shí)驗(yàn)GSH的抽提方法。其次，采用超濾膜為5000Da的超濾分離系統(tǒng)除去GSH提取液中的大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并通過(guò)陽(yáng)離子交換層析對(duì)GSH提取液進(jìn)一步純化，最終得到GSH洗脫峰，GSH的回收率為70.7％。最后，通過(guò)真