丙型肝炎抗病毒治療失敗中病毒全基因組變異的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染人體后，75-85％會(huì)發(fā)展為慢性丙型肝炎，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌細(xì)胞，發(fā)病較隱匿，具有更大的危害性，嚴(yán)重影響了人民的生命健康，但目前尚無(wú)有效的疫苗預(yù)防HCV感染，公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療方案僅有聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)或普通干擾素(IFN)聯(lián)合利巴韋林治療進(jìn)行為期24周-48周的治療，其費(fèi)用昂貴，副反應(yīng)多，療效卻不理想。不同基因型HCV感染者抗病毒療效

2、存在巨大差異，基因1型患者，治療結(jié)束達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)率約為39.8-40.9％；基因2型、3型的感染者持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率卻能夠達(dá)到75-80％。在我國(guó)，HCV感染以基因1b型為主，眾多基因1b型丙型肝炎患者在忍受了48周干擾素抗病毒治療的副反應(yīng)后，卻仍然沒(méi)有良好的治療效果，有的在治療過(guò)程中反彈(breakthrough)，有的在停藥后復(fù)發(fā)(relapse)，有的甚至完全無(wú)應(yīng)答(non-response)。目前普遍認(rèn)為干擾素抵抗

3、(IFN resistance)的發(fā)生是導(dǎo)致抗病毒治療失敗的重要原因，但其具體機(jī)制尚不明確，因此，在丙型肝炎治療的研究中要解決的一個(gè)重要問(wèn)題就是闡明難治性丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制及應(yīng)對(duì)策略，為丙型肝炎患者抗病毒治療提供療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，并為改善抗病毒應(yīng)答療效提供新的思路。
　　 不同HCV基因型患者間抗病毒SVR率的巨大差異直接提示病毒因素在干擾素抗病毒治療中起著重要作用，提示應(yīng)該著重從病毒因素開(kāi)展相應(yīng)研究。盡管已有許多研究表明多個(gè)HCV

4、蛋白與干擾素抵抗發(fā)生相關(guān)，包括NS5A上的ISDR、PKR-BD、V3、V4和IRRDR，E2上的PePHD、HVR1、HVR2、HVR3，NS4A以及Core，但是目前這些研究都沒(méi)有達(dá)成一個(gè)明確的共識(shí)，并且體內(nèi)和體外的研究結(jié)果還有許多相互矛盾的結(jié)論?？共《局委熤蟹磸椈颊咦畛鯇?duì)干擾素抗病毒治療應(yīng)答良好，HCVRNA水平也能降到最低檢測(cè)值以下，但卻在治療過(guò)程中出現(xiàn)血清HCV RNA復(fù)陽(yáng)，這類患者作為病毒因素的研究對(duì)象或許更能排除眾多混雜因

5、素，在這類患者中更易研究HCV基因組變異和進(jìn)化是否在干擾素抵抗發(fā)生中起任何作用，因?yàn)楦蓴_素抵抗的HCV病毒準(zhǔn)種株很有可能在治療的過(guò)程中被篩選出來(lái)。因此，本研究旨在分析和比對(duì)這類患者治療前、治療中以及停藥后病毒全長(zhǎng)基因組序列變化情況，同時(shí)改造和構(gòu)建新的HCV全長(zhǎng)基因組復(fù)制子模型在體外驗(yàn)證并鑒定相關(guān)變異干擾素抵抗發(fā)生的確切相關(guān)性。
　　 方法：
　　 對(duì)接受干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的19例基因1b型慢性丙型肝炎患者的臨床

6、轉(zhuǎn)歸情況進(jìn)行系統(tǒng)分析，根據(jù)抗病毒療效，選擇具有代表性的一例治療中反彈患者和一例完全無(wú)應(yīng)答患者在停藥后繼續(xù)隨訪至第5年，根據(jù)留取的基線、抗病毒治療第48周(W48)和停藥后第5年(Year5)的病毒血清，通過(guò)血清微量HCV RNA抽提技術(shù)、長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)、HCV全長(zhǎng)讀碼框序列的拼接技術(shù)等獲得入選2例患者基線、W48和Year5的全長(zhǎng)基因組HCV序列，通過(guò)Vector NTI軟件和BioEdit軟件比對(duì)分析2例患者在治療前、治療

7、中及停藥后病毒基因組的變異和進(jìn)化情況。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，改造基因1b型HCV全長(zhǎng)基因組復(fù)制子質(zhì)粒sfl-Conl，引入點(diǎn)突變構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)置換臨床患者體內(nèi)HCV治療前后發(fā)生明顯變異的相關(guān)序列，體外轉(zhuǎn)錄后獲得HCV RNA轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞系建立含有臨床患者體內(nèi)特異性變異相關(guān)序列的復(fù)制子細(xì)胞模型，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體外干擾素處理上述復(fù)制子細(xì)胞后其胞內(nèi)HCV RNA的變化。
　　 結(jié)果：
　　 19例基因1b型

8、慢性丙型肝炎患者接受普通干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的應(yīng)答情況，SVR率為47.7％(9/19)，經(jīng)過(guò)48周的抗病毒治療，治療后肝臟炎癥壞死評(píng)分(HAI)明顯降低，以達(dá)到SVR的患者最為明顯(P=0.039)。
　　 抗病毒治療期間，在治療反彈患者中，整體HCV讀碼框的核苷酸水平的變異率為1.97％，氨基酸水平為1.43％，明顯高于無(wú)應(yīng)答患者(核苷酸水平為0.74％，氨基酸水平為0.40％)。在治療中反彈患者中基線與48周的比較

9、，HCV功能蛋白P7和NS2區(qū)域的變異率最高(P7蛋白，核苷酸水平為5.82％，氨基酸水平為4.76％；NS2蛋白，核苷酸水平為4.45％，氨基酸水平為3.69％)。在治療中反彈患者中，A-B-B和A-A-B類型是主要的變異類型，分別占47.14％和40.0％，A-B-C類型最少，占1.43％。在無(wú)應(yīng)答患者中，A-A-B變異類型最多，占67.57％。
　　 體外干擾素處理復(fù)制子細(xì)胞結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入反彈患者治療后p7-NS2片段的復(fù)

10、制子HCV RNA，在干擾素濃度分別為10u/ml和100u/ml時(shí)均較轉(zhuǎn)入治療前p7-NS2片段的復(fù)制子中HCV RNA相對(duì)含量更高(P=0.003，P=0.0023)。
　　 結(jié)論：
　　 基因1b型慢性丙型肝炎接受普通干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，雖然抗病毒治療達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率有限，但仍能夠有效改善肝臟組織炎癥壞死程度。
　　 在干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療期間，完全無(wú)應(yīng)答患者體內(nèi)丙型肝炎病毒的變異率

11、較低，而治療中反彈患者較易發(fā)生變異，以p7和NS2變異率最高，并且在治療過(guò)程中發(fā)生的變異在停藥后多數(shù)能夠保留下來(lái)，提示這些變異可能對(duì)病毒適應(yīng)性影響不大。
　　 基因1b型HCV全基因組復(fù)制子sfl-Conl體外轉(zhuǎn)錄后經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞系后能夠構(gòu)建有效的HCV體外復(fù)制子細(xì)胞模型，該模型HCV克隆中置換入臨床來(lái)源的p7-NS2片段后仍能在Huh-7.5.1細(xì)胞中有效復(fù)制。
　　 體外干擾素處理實(shí)驗(yàn)表明，抗病毒