凝血因子Ⅷ分離過程中效價(jià)衰減的初步分析.pdf

1、目的：
　　開展原料血漿篩選、速凍、融漿循環(huán)保溫系統(tǒng)控制等方面的研究，從源頭保護(hù)凝血因子Ⅷ制品的生物學(xué)活性，控制效價(jià)衰減。通過對凝血因子Ⅷ純化過程中導(dǎo)致其效價(jià)衰減的內(nèi)外環(huán)境因素的分析，對制備工藝過程進(jìn)行最大程度的優(yōu)化，得到凝血因子Ⅷ的最佳純化條件。
　　方法：
　　1.通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)確定能夠保證凝血因子Ⅷ效價(jià)最高的前處理?xiàng)l件，實(shí)驗(yàn)中分別對血漿的速凍和保存溫度、融漿溫度、冷沉淀制取過程中的離心溫度、離心機(jī)轉(zhuǎn)速四

2、個(gè)因素進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，研究了這四個(gè)因素對凝血因子Ⅷ效價(jià)的影響情況和最佳的冷沉淀制備條件。
　　2.為防止凝血因子Ⅷ在后續(xù)非低溫條件被大量激活，選擇合適條件的緩沖液溶解冷沉淀。通過實(shí)驗(yàn)確定去除溶液中纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的酸堿度調(diào)節(jié)的條件，以及通過吸附法去除其中等電點(diǎn)較低的小分子雜質(zhì)。
　　3.采用離子交換技術(shù)分離純化制品，通過冷凍干燥參數(shù)設(shè)計(jì)對單因素條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選，根據(jù)效價(jià)衰減情況選擇最優(yōu)化的凝血因子Ⅷ分離純化方案

3、。
　　4.各步實(shí)驗(yàn)得到的半制成品、制成品的凝血因子Ⅷ的效價(jià)評價(jià)方法均采用全自動(dòng)凝血儀檢測。
　　結(jié)果：
　　1.前處理過程中對凝血因子Ⅷ生物學(xué)活性有影響的四個(gè)因素的研究結(jié)果表明：速凍和保存溫度-40℃，融漿循環(huán)保溫系統(tǒng)溫度2℃，冷沉淀制取過程中的離心溫度4℃，離心機(jī)的離心力2500 g，凝血因子Ⅷ效價(jià)最高。
　　2.冷沉淀選擇具有抗凝作用的檸檬酸鈉溶解，稀釋倍數(shù)1：6。去除雜蛋白酸堿度調(diào)節(jié)在pH6.5時(shí)凝血因子

4、Ⅷ效價(jià)損失較小，纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白去除率較高；去除其他小分子雜質(zhì)選用的吸附劑為二乙基氨基乙基-葡聚糖 A-50凝膠凝血因子Ⅷ效價(jià)損失最低。
　　3.離子交換技術(shù)中采用DEAE-650（M）弱堿性陰離子交換劑，其他雜質(zhì)蛋白去除較充分。冷凍干燥的最佳條件為預(yù)凍4 h，升華干燥溫度-15℃，時(shí)間36 h，真空壓力設(shè)為30 Pa，解析干燥溫度36℃，真空壓力設(shè)為5 Pa。經(jīng)上述制備過程，凝血因子Ⅷ效價(jià)損失最小，終產(chǎn)品的因子Ⅷ效價(jià)為7

5、9.31 IU/mg。
　　結(jié)論：
　　1.制備血漿冷沉淀的過程中，原料血漿速凍溫度和保存溫度設(shè)定為-40℃，融漿溫度設(shè)定為2℃，離心溫度設(shè)為4℃，離心機(jī)的離心力2500 g，得到的冷沉淀中凝血因子Ⅷ效價(jià)最高。
　　2.冷沉淀與緩沖液的混合比例設(shè)定在1：6，將血漿冷沉淀溶解在檸檬酸鈉緩沖液中效果最好。
　　3.pH6.5時(shí)沉淀法除去纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白等大分子雜蛋白，A-50凝膠吸附法去除其它小分子量的凝血因