蝰蛇(緬甸亞種)蛇毒凝血因子X激活物Fla的分離及其凝血活性研究.pdf

1、目的：以蝰蛇（緬甸亞種）蛇毒干粉為研究對(duì)象，分離出一個(gè)具有凝血活性的組分Fla，并對(duì)其凝血特點(diǎn)和機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 方法：經(jīng)過CM-Sephadex C-50陽離子交換層析，Sephadex G-75凝膠層析及在Akta蛋白快速純化系統(tǒng)上應(yīng)用 TSK-G2000 SWx1柱分離得到一個(gè)具有凝血活性的組分Fla。以質(zhì)譜測(cè)定其分子量，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)。用Williams和Esnouf的方法測(cè)定Fla對(duì)人貧血小板血漿的凝

2、血作用，用特異性底物法研究Fla對(duì)凝血因子X（FX）和凝血酶原的激活作用。按Rong Gao和Manjunatha的方法研究Fla對(duì)纖維蛋白原作用；用纖維平板法研究Fla對(duì)纖維蛋白的降解作用；并測(cè)定不同溫度、不同pH，以及不同抑制劑對(duì)Fla促凝血活性的影響；采用PE公司的ABI491A儀器測(cè)定FlaN端20個(gè)氨基酸的序列。
　　 結(jié)果：經(jīng)三步分離得到Fla，其血液凝固時(shí)間為290±5 s/31.25μg（n=3）。由1 g粗毒得

3、到10.75 mgFla，最終的回收率為1.1％。分子量為32，589 Da，等電點(diǎn)為7.2。染色檢測(cè)顯示Fla為糖蛋白。Fla可激活凝血因子X，但不能激活凝血酶原，不能降解纖維蛋白原和纖維蛋白。Fla發(fā)揮促凝效應(yīng)的適宜pH為7.0～8.0，適宜溫度為30～50℃；EDTA可以抑制Fla的活性，而PMSF對(duì)其活性無影響。Fla的N端序列為NH2-V-I-G-G-D-E-C-N-I-N-E-H-P-F-L-A-L-M-Y-Y。
　　

4、 結(jié)論：蝰蛇（緬甸亞種）蛇毒經(jīng)過CM-Sephadex C-50陽離子交換層、Sephadex75凝膠層析、在Akta快速蛋白純化系統(tǒng)上用 TSK-G2000 SWx1柱再次凝膠層析分離得到具有促凝作用的Fla，為單鏈糖蛋白，金屬蛋白酶，其分子量為32，589 Da，等電點(diǎn)為7.2左右；其促凝活性與激活FX相關(guān)；Fla促凝活性的適宜pH為7.0～8.0，適宜溫度為30～50℃；N端20個(gè)氨基酸的序列為NH2-V-I-G-G-D-E-C