中國(guó)漢族人群印記SNP甄選、驗(yàn)證及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 本課題旨在充分利用人類基因組印記基因圖譜及國(guó)際人類基因組單倍型圖（Hapmap）、中國(guó)人遺傳背景的基因組多態(tài)性等大型基因組計(jì)劃的最新研究成果，初步篩選在中國(guó)漢族人群中具有良好頻率分布的親源特異性甲基化遺傳標(biāo)記印記SNP位點(diǎn)；建立甲基化敏感酶切結(jié)合單堿基延伸技術(shù)，驗(yàn)證印記SNP等位基因的親代來(lái)源；并用建立的方法對(duì)所驗(yàn)證的親源特異性甲基化遺傳標(biāo)記印記SNP進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定應(yīng)用學(xué)研究。
　　 方法：<

2、br>　　 從人類基因組印記基因圖譜中初步篩選出候選印記基因，在Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取其單核苷酸多態(tài)性( SNP)相關(guān)數(shù)據(jù)，所選印記基因的SNP經(jīng)Haploview分析軟件分析后，篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的11個(gè)SNP位點(diǎn)（IGF2AS rs1003483、SNURF rs220028、rs4906939、DLGAP2 rs6558478、PKP3 rs11748、CHMP2A rs873104、COL9A3 rs760087.SIM2

3、rs737380、TP73 rs3765730、SOX8 rs9931183、APBA1 rs11139063);由于優(yōu)化擴(kuò)增條件的限制，進(jìn)行了8個(gè)SNP(IGF2AS rs1003483、SNURF rs220028，rs4906939 DLGAP2rs6558478、PKP3 rs11748、CHMP2A rs873104、COL9A3 rs760087、SIM2 rs737380)的復(fù)合擴(kuò)增，使用復(fù)合擴(kuò)增后單堿基延伸技術(shù)(Snap

4、shot)檢測(cè)10例家系（STR檢驗(yàn)證實(shí)為親子關(guān)系）樣本8個(gè)印記SNP等位基因的分型；使用甲基化敏感酶切結(jié)合Snapshot技術(shù)驗(yàn)證3個(gè)SNP（SNPIGF2AS rs1003483、SNURFrs220028、rs4906939）等位基因的印記親代來(lái)源；篩選出印記基因差異甲基化區(qū)親代來(lái)源特異的印記SNP進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)研究。
　　 結(jié)果：
　　 根據(jù)本課題選點(diǎn)原則篩選出11個(gè)SNP,由于擴(kuò)增條件限制，進(jìn)行了8個(gè)SNP的

5、復(fù)合擴(kuò)增；成功建立了甲基化敏感酶切聯(lián)合復(fù)合擴(kuò)增后Snapshot微測(cè)序法，這一方法為簡(jiǎn)單、高效的DNA甲基化標(biāo)記和SNP聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)；本實(shí)驗(yàn)對(duì)10組家系樣本（STR證實(shí)為親子關(guān)系）采用甲基化敏感酶切聯(lián)合復(fù)合擴(kuò)增后Snapshot微測(cè)序法進(jìn)行8個(gè)印記SNP的等位基因分型檢測(cè)，篩選出3個(gè)印記基因差異甲基化區(qū)的SNP即親代來(lái)源特異的印記SNP，分別為IGF2AS rs1003483、SNURF rs220028和SNURF rs4906939

6、。法醫(yī)應(yīng)用學(xué)研究表明：三個(gè)印記SNP復(fù)合系統(tǒng)具有較高的種屬特異性；該體系的檢測(cè)靈敏度為(0.25ng);通過(guò)1個(gè)檢案證明：8個(gè)位點(diǎn)符合法醫(yī)學(xué)遺傳規(guī)律，且當(dāng)孩子的等位基因?yàn)殡s合時(shí)，使用甲基化敏感酶切聯(lián)合復(fù)合擴(kuò)增后Snapshot微測(cè)序技術(shù)檢測(cè)三個(gè)印記SNP等位基因分型，可以直接判定等位基因的親源，從而確定親代的必需等位基因。
　　 結(jié)論：
　　 甲基化敏感的限制酶消化后PCR聯(lián)合單核苷酸引物延伸技術(shù)(Snapshot)是一