法醫(yī)毒理學中藥物代謝與中國漢族人群CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)分析.pdf

1、涉毒案件是法醫(yī)學鑒定的重要內容之一。由于人類對毒藥物的代謝存在顯著的個體差異，因而中毒案件的法醫(yī)毒理學分析應充分考慮個體遺傳因素，結合藥物基因組學進行結果解釋。細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是人體中最重要的藥物代謝酶。遺傳機制的研究顯示，藥物代謝的個體差異主要由CYP基因多態(tài)性所致，若CYP基因出現(xiàn)堿基缺失、插入、替換、顛換等類型的突變，就會使氨基酸序列改變，導致所表達的CYP酶降低活性或者喪失活性，最終引起

2、藥物代謝異常而中毒。
　　單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，在疾病相關性研究、藥物基因組學、法醫(yī)學等研究中發(fā)揮了重要作用。近年來基于SNP分型的藥物基因組學逐漸在毒理學研究方面嶄露頭角，其不僅可用于篩選異常代謝人群，也可為毒理學作用機制的研究提供新的方向和方法。基質輔助激光解吸電離質譜(Matrix-assisted laser desorp

3、tionionization-time of flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)基因分型技術因其高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)點，更符合法醫(yī)生物學檢材的要求，適用于CYP基因的SNP位點分型。生物樣品前處理方法一直以來是毒物分析的一個研究難點。分子印跡技術(Molecular imprinting technique，MIT)是近幾年發(fā)展起來的新型分子識別分離技術，因其識別性好、專一性高，可應用于生物檢

4、材中毒藥物及其代謝物的分離分析。
　　本論文在國內首次針對中國漢族人群CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2基因座上的50個SNP位點進行了大規(guī)模篩查分析，并在現(xiàn)有研究成果以及現(xiàn)代毒物分析技術和SNP分型技術的研究基礎和起點上，以司法鑒定實踐中廣泛涉及的新一代非“苯二氮卓”藥物唑吡坦(Zolpidem，思諾思)和阿片類藥物可待因為研究對象，創(chuàng)建了體內毒藥物及其代謝物的篩選分析體系和確證定量方法，自主

5、研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取小柱并申請專利，用于血液和尿液中唑吡坦的分離分析。通過志愿者實驗，首次考察了中國漢族人群中CYP基因多態(tài)性的分布情況，首先報道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關系，在國內率先進行了將藥物基因組學應用于法醫(yī)毒理學的探索研究。主要的研究內容分為以下七部分:
　　第一部分 CYP基因分型方法的研究及評價
　　研究顯示，CYP2D6，CYP2C19，CYP2C9，CYP3A4和CYP1A2參與

6、了大部分的藥物代謝。篩選出這些基因座上的50個SNP位點，創(chuàng)建了基于復合PCR和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術的CYP基因分型方法，并檢測了200例健康中國漢族人群的血樣，得到了這50個SNP位點的基因分布頻率。引物是根據(jù)MassARRAY Assay設計軟件設計，由0.5mL全血抽提基因組DNA，經(jīng)過復合PCR得到含SNP位點的片段。MALDI-TOF-MS檢測之前再經(jīng)過單堿基延伸和產物純化，即得到檢

7、測結果。同時以已知基因型的DNA樣品作為質量控制樣品。結果發(fā)現(xiàn)，CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4和CYP1A2基因座上的17個SNP位點具有多態(tài)性。首次報道8個位點(rs16947，rs28371725, rs1800754, rs4244285, rs4986893, rs12248560, rs3758580, rs2242480)的分布頻率在中國漢族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p＜0.01)，2

8、個位點的分布頻率和現(xiàn)存中國漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p＜0.01)。通過驗證，所建立的MALDI-TOF-MS SNP分型方法的準確度是100％。因此，該方法檢測結果可信且適用于高通量的基因分型研究，提高了法醫(yī)毒理學中毒藥物相關基因篩選的效能。
　　第二部分常見毒藥物的LC-MS/MS篩選體系的建立
　　為了研究體內毒藥物的代謝情況，創(chuàng)建了生物檢材中170種常見毒藥物的液相色譜串聯(lián)質譜(Liquid chromat

9、ography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)篩選分析體系。采用多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，以目標物的保留時間和母離子/子離子對為指標進行篩選分析。建立了LC-MS/MS庫和定性認定標準，并考察了分析方法的有效性。多反應監(jiān)測篩選體系兼具有選擇離子掃描的靈敏度和二級質譜的特征性，血液中170種毒藥物篩選分析的最低檢出限為0.1～10ng/mL，其

10、中85％的毒藥物檢出限≤1ng/mL，達到國際領先水平。該篩選分析體系能滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物學檢測中毒或治療濃度目標物的需要，為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)分析提供了技術儲備，在司法鑒定實踐中有重要的應用價值。
　　第三部分唑吡坦分子印跡固相萃取柱的制備及應用
　　生物樣品尤其是血液、尿液中目標物的分離分析技術是本課題研究的基礎。目前，生物檢材中的唑吡坦分析，主要采用液液提取或固相萃取等前處理后進行液相色譜

11、串聯(lián)質譜分析。分子印跡技術(Molecular imprinting technique，MIT)是近幾年發(fā)展起來的新型分子識別分離技術，因其識別性好、專一性高，可應用于生物檢材中毒藥物及其代謝物的分離分析。本課題以唑吡坦為模板，自主研發(fā)了特異性強、選擇性高的分子印跡聚合物提取柱，建立了相應的分子印跡固相萃取方法，并申請了一項發(fā)明專利。以血液為檢材，提取物用UPLC-MS/MS方法檢測分析。對該方法進行方法學驗證，并與傳統(tǒng)的固相萃取技術

12、進行了比較，發(fā)現(xiàn)該分子印跡固相萃取柱選擇性強、靈敏度高（最低檢測限為0.2ng/mL），適用于法庭科學領域唑吡坦相關實際案例的檢測分析。
　　第四部分 UPLC-MS/MS法檢測血液、尿液中的唑吡坦及其代謝物
　　為研究唑吡坦的體內代謝情況，本課題首次建立了同時檢測生物檢材中唑吡坦及其主要代謝物6-羧酸唑吡坦(zolpidem6-carboxylic acid，ZCA)及苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidem phenyl-

13、4-carboxylic acid，ZPCA)的超高效液相色譜串聯(lián)質譜(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析方法，并應用于鑒定實踐。取0.1mL血液或尿液，加入0.9mL的乙腈（含0.1％甲酸）進行蛋白沉淀。離心后取上清液吹干，用100μL甲醇定容后進API4000Q分析，分析柱為AcquityTM UPLC HSS

14、T3(100 mm×2.1mm，1.8μm)柱。流動相為乙腈和水（含20 mmol/L乙酸銨和0.1％甲酸），流速為0.5mL/min。血液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1-300ng/mL，0.1-500ng/mL，0.1-200ng/mL，尿液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1～600 ng/mL，0.1～600 ng/mL，0.1～300 ng/mL。三種化合物的檢出限和定量限分別為0.05 ng/m

15、L和0.1 ng/mL，方法的線性相關性≥0.9995，日間和日內精密度在10％以內，回收率為70.0-98.3％，基質效應為79.5-99.0％。該方法簡單、快速、靈敏，能夠有效地解決唑吡坦涉藥案件，提高突發(fā)案（事）件的快速鑒定能力。
　　第五部分唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)性分析
　　以臨床廣泛應用，并在藥物輔助犯罪案件(Drug-facilitated sexual assault，DFSA)中經(jīng)常涉及到的新一代

16、非“苯二氮卓”藥物唑吡坦為研究對象，為了考察唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)性，選取200名漢族健康志愿者分析其基因型，篩選出具有突變基因的人群并分為4組:CYP3A4*18(wild-type，W)，CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(mutant,M),CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(W),CYP2C19*2(M); CYP3A4*18(M)，CYP2C19*2(M)。志愿者口服治療劑量的酒石酸唑吡坦后

17、采集其血液、尿液樣品進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，唑吡坦的氧化代謝主要是通過細胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。首次報道，若發(fā)生CYP3A4*18的突變，則會增強CYP3A4酶的活性，從而引起該基因突變人群對唑吡坦的代謝增強;若發(fā)生CYP2C19*2的突變，則會降低CYP2C19酶的活性，從而引起中國漢族人群對唑吡坦的弱代謝。該研究成果提出，不同人群對唑吡坦的代謝存在個體差異，解釋相關案件時應充分考慮個體遺傳因素。
　　第六部

18、分 UPLC-MS/MS法檢測尿液中的可待因及其代謝物
　　為研究可待因的體內代謝情況，本課題創(chuàng)建了尿液中可待因及其代謝物的超高效液相色譜串聯(lián)質譜分析方法。以嗎啡-d3(MOR-d3)和嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷-d3(M3G-d3)為內標，尿樣用乙腈沉淀蛋白后，過SiroccoTM蛋白沉淀板，UPLC-MS/MS法分離檢測尿樣的中嗎啡(MOR)、嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷(M3G)、嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)和可待因(COD)。尿

19、樣中COD的檢出限為0.2ng/mL，定量限為0.5 ng/mL; MOR、M3G和M6G檢出限為0.5 ng/mL，定量限為1 ng/mL;線性相關系數(shù)r≥0.9997;日內精密度在5％以內，日間精密度在10％以內;日內準確度大于97％，日間準確度大于94％，回收率在90％以上，基質效應在45％-90％。所建方法簡便、快速、準確，可適用于法醫(yī)毒理學中可待因相關案件的分析鑒定。
　　第七部分可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)性分析

20、
　　以臨床廣泛應用，并易造成濫用成癮的藥物可待因為研究對象，為了考察可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)性，選取20名健康志愿者口服治療劑量的復方磷酸可待因口服溶液后分時段留尿，采用UPLC-MS/MS方法檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)志愿者在單次給藥0.5h內，MOR、COD濃度即達到峰值，而M3G濃度則在1h后達到峰值，M6G濃度在6h時達到峰值。另有2名志愿者因rs2242480基因突變(CYP3A4)，其嗎啡峰值出現(xiàn)在72h，M3

21、G和M6G峰值也出現(xiàn)在72h，可待因的峰值出現(xiàn)在80h。結果表明，該2名志愿者可能為可待因慢代謝者(PM)，攝入的可待因在人體內代謝緩慢，易造成藥物蓄積。同時指出，CYP2D6基因突變易造成超強代謝者(UM)，導致嗎啡過量而引起中毒，但本項研究尚未發(fā)現(xiàn)有超強代謝者。
　　小結
　　本課題創(chuàng)建了基于復合PCR和MALDI-TOF MS的中國漢族人群CYP基因座上50個SNP位點的基因分型方法，首次報道8個位點的分布頻率在中國漢

22、族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p＜0.01)，2個位點的分布頻率和現(xiàn)存中國漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p＜0.01)。該方法檢測結果可信且適用于高通量的基因分型研究，提高了法醫(yī)毒理學中毒藥物相關基因篩選的效能。同時本研究首次建立了唑吡坦及其代謝物、可待因及其代謝物的UPLC-MS/MS確證定量分析方法，并自主研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取柱用于唑吡坦的分離分析，申請發(fā)明專利一項。本論文還建立了170種毒藥物的LC-MS/MS

23、分析篩選體系，為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)分析提供了技術儲備。所建方法簡便、快速、準確，能夠有效地解決攝毒、涉藥案件，提高突發(fā)案（事）件的快速反應能力和鑒定效能。
　　在國內率先通過志愿者實驗，考察了唑吡坦、可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關聯(lián)性。結果發(fā)現(xiàn):唑吡坦的氧化代謝主要是通過細胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。若發(fā)生CYP3A4*18的突變，則會增強CYP3A4酶的活性，從而引起該基因突變人群對唑

24、吡坦的代謝增強。若發(fā)生CYP2C19*2的突變，則會降低CYP2C19酶的活性，從而引起中國漢族人群對唑吡坦的弱代謝?？纱虻拇x主要是通過CYP2D6和CYP3A4，若發(fā)生CYP2D6基因突變則易引起超強代謝類型，若發(fā)生CYP3A4突變則易會引起可待因弱代謝型。
　　本研究首次報道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關系，在國內率先進行了將藥物基因組學應用于法醫(yī)毒理學的探索研究，該研究結果可用于解釋不同人群對唑吡坦及可待