Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性CTL抑制轉(zhuǎn)基因小鼠HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討泛素（Ubiquitin）修飾乙肝病毒核心抗原肽（HBcAg）經(jīng)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（CTP）轉(zhuǎn)導(dǎo)在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)分泌Th1型細(xì)胞因子及HBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，并進(jìn)一步驗(yàn)證融合蛋白Ub-HBcAg-CTP在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的抑制HB V病毒復(fù)制功能。
　　方法：1. BALB/c-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組Ub-HBcAg-CTP（50μg），對照組HBcAg-CTP（50μg）、Ub-HBcAg（

2、50μg）、IFN-a（20000IU）、HBcAg（50μg）及空白組（PBS）分別肌肉注射免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，每周1次，共免疫3次。通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測 T淋巴細(xì)胞分泌 Th1細(xì)胞因子；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測 T淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子；乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測T淋巴細(xì)胞的殺傷活性。2. HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組Ub-HBcAg-CTP（50μg），對照組HBcAg-CT

3、P（50μg）、Ub-HBcAg（50μg）、IFN-a（20000IU）、HBcAg（50μg）及空白組（PBS）經(jīng)肌肉免疫小鼠，每周1次，共3次。分別于免疫過程中第2周及第4周對免疫小鼠行內(nèi)眥取血，獲取各組血清共2次，分別通過微粒子酶免疫分析法（MEIA）對2次小鼠血清行乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平檢測，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分別測定2次血清中HBV DNA水平，并用免疫生化檢測末次血清的AST、ALT水平，同時對免疫

4、后小鼠肝臟組織行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測肝組織中HBsAg、HBcAg蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)組融合蛋白Ub-HBcAg-CTP能有效誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠T淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子；FCM檢測實(shí)驗(yàn)組融合蛋白能有效增加特異性CTL數(shù)量，所誘導(dǎo)的CTL水平明顯高于其他組；且Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞CTL活性明顯高于對照組及空白組（p值均<0.05）。2. Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫轉(zhuǎn)基

5、因小鼠后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平較其他對照組均明顯降低，表示Ub-HBcAg-CTP對轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV水平有一定抑制作用，且Ub-HBcAg-CTP組小鼠血清中AST、ALT水平高于其他對照組（p值均<0.05）。同時實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織 HE染色顯示炎性細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，而免疫組化分析顯示其肝組織中HBsAg、HBcAg蛋白表達(dá)量明顯減少。
　　結(jié)論：強(qiáng)制泛素修飾抗原肽 HBcAg經(jīng) CTP轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫