轉(zhuǎn)錄因子Blimp1和BCDA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中高表達(dá)的意義研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)簡(jiǎn)稱(chēng)紅斑狼瘡，是由多克隆自身反應(yīng)性物B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其直接的致病因子是多克隆自身抗體，并以免疫復(fù)合物的形式造成多種組織器官損傷。對(duì)于引起SLE的確切病因仍然不很明確，但是自身抗體對(duì)SLE的發(fā)病起到了很重要的作用已是共識(shí)。目前臨床上治療SLE最常用的措施是使用非特異性免疫抑制劑、細(xì)胞毒藥物和激素，盡管這些藥物能有效地抑制免疫活性細(xì)胞，控制疾病病程

2、，但毒副作用比較明顯，另一方面由于用藥后自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞持續(xù)存在，因此很難達(dá)到治愈的目的。近年來(lái)針對(duì)分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞治療紅斑狼瘡雖然取得了很大進(jìn)展，但是此策略因?yàn)椴荒苡行宄凉{細(xì)胞，體內(nèi)長(zhǎng)壽漿細(xì)胞依然分泌自身抗體，這些抗體可再次激活病理性免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致SLE患者復(fù)發(fā)，所以尋求針對(duì)分泌抗體的漿細(xì)胞的新靶標(biāo)成為核心問(wèn)題。
　　目的：
　　本研究旨在探索重慶地區(qū)活動(dòng)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，外周血促B淋巴細(xì)胞

3、成熟蛋白1(Blimpl/PRDMl)、B淋巴細(xì)胞成熟抗原(BCDA)表達(dá)和CD138+漿細(xì)胞數(shù)量和健康人之間的是否存在差異，揭示PRDM1、BCDA表達(dá)與CD138+漿細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系。同時(shí)通過(guò)紅斑狼瘡動(dòng)物模型和正常動(dòng)物對(duì)比，了解Blimp1在動(dòng)物不同組織的表達(dá)情況，以及揭示Blimp1與紅斑狼瘡之間的關(guān)系。本研究的開(kāi)展將明確Blimp1可否成為以漿細(xì)胞為靶細(xì)胞治療紅斑狼瘡，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療紅斑狼瘡的新藥奠定基礎(chǔ)，還可以為治療其他漿

4、細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物設(shè)計(jì)提供新的策略
　　方法
　　1.收集40例SLE患者血液標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，30例健康體檢血液標(biāo)本為對(duì)照組。提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR(FQ-PCR)，根據(jù)相對(duì)定量法計(jì)算PRDM1、BCMAmRNA相對(duì)表達(dá)情況。
　　2.收集40例SLE患者血液標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，30例健康體檢血液標(biāo)本為對(duì)照組。Ficoll梯度離心收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照CD38-FITC，CD

5、56-PE，CD45-PC5；CD19-FITC，CD138-PE，CD45-PC5；IgG1-PE/IgG1-FITC/IgG1-PC5，CD45-PC5三組標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)研究CD138+漿細(xì)胞量的差異。
　　3.紅斑狼瘡模型小鼠和正常對(duì)照小鼠在16周齡時(shí)乙醚麻醉處死，取腎臟、脾臟及淋巴結(jié)組織，行免疫組化、免疫印跡、HE染色，觀察Blimpl蛋白表達(dá)以及病理變化。提取上述組織總RNA，行RT-PCR和電泳，測(cè)量Blimp

6、1凝膠光密度OD值，計(jì)算模型小鼠和正常小鼠Blimpl mRNA表達(dá)相對(duì)倍數(shù)。
　　結(jié)果
　　1.經(jīng)過(guò)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件t檢驗(yàn)計(jì)算得出SLE實(shí)驗(yàn)組PRDM1和BCMA的△ct值和體檢對(duì)照組的△ct值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組PRDM1△ct為0.67，BCMA△ct為0.81；對(duì)照組PRDM1△ct是1.74，BCMA△ct為1.72。通過(guò)相對(duì)定量2-△△ct法計(jì)算，得到SLE實(shí)驗(yàn)組的PRDM1 mRNA

7、的含量是體檢對(duì)照組的2.09倍，SLE實(shí)驗(yàn)組的BCMA mRNA的含量是體檢對(duì)照組的1.87倍。
　　2.用流式細(xì)胞技術(shù)分析，結(jié)果提示SLE患者和健康對(duì)照者外周血CD138+漿細(xì)胞數(shù)量差異明顯。
　　3.經(jīng)Imagepro-Plus6.0軟件檢測(cè)免疫組化(IHC)光密度OD值，結(jié)果顯示Blimpl蛋白在SLE模型小鼠的腎臟、脾臟及淋巴結(jié)組織內(nèi)表達(dá)明顯高于正常小鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均小于0.05)。其結(jié)果顯示Blimpl蛋白

8、在SLE模型小鼠的腎臟、淋巴結(jié)及脾臟組織表達(dá)分別是正常小鼠的1.57、1.86、2.00倍。經(jīng)quantity one軟件分析Western Blot，PCR產(chǎn)物電泳凝膠的光密度OD值(P均小于0.05)，Western Blot果結(jié)顯示Blimpl蛋白在SLE模型小鼠的腎臟、淋巴結(jié)及脾臟組織表達(dá)分別是正常小鼠的1.54、1.99、2.21倍；Blimpl mRN，A在SLE模型小鼠的腎臟、淋巴結(jié)及脾臟組織表達(dá)分別是正常小鼠的1.76、

9、2.02、2.05倍。HE染色結(jié)果顯示腎臟間質(zhì)內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶性漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。偶見(jiàn)腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，基底膜略增厚。淋巴結(jié)淋巴濾泡增生，生發(fā)中心擴(kuò)大。脾臟脾小體明、暗區(qū)結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)紅髓中多核巨細(xì)胞增生明顯，小動(dòng)脈周增生及出現(xiàn)少量漿細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.證實(shí)在SLE患者外周血PRDM1和BCMA mRNA高表達(dá)，CD138+漿細(xì)胞數(shù)量的增多與PRDM和BCMA高表達(dá)相關(guān)。PRDM1和BCM