抑制轉(zhuǎn)錄因子Blimp1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以高水平自身抗體、B細(xì)胞高反應(yīng)性、累及多個(gè)臟器為特點(diǎn)的復(fù)雜自身免疫性疾病。目前臨床治療SLE多采用糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑等非特異性免疫抑制療法，抑制自身免疫反應(yīng)的同時(shí)不可避免的帶來了肝毒性、胃腸炎等副作用。自身抗體是SLE的重要致病因素，漿細(xì)胞是抗體的直接來源，提示漿細(xì)胞靶向治療SLE可能直接抑制或減少自身抗體的產(chǎn)生

2、。B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1(B lymphocyte induced maturation protein1，Blimp1)是誘導(dǎo)漿細(xì)胞發(fā)育成熟及維持漿細(xì)胞存活和抗體分泌能力的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，我們課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)Blimp1在SLE中高表達(dá)，并與SLE疾病活動(dòng)度、自身抗體滴度及漿細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)，提示Blimp1可能成為診斷SLE并判斷其病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，抑制Blimp1表達(dá)可能是漿細(xì)胞靶向治療SLE的新方向。
　　目的：

3、　　本研究旨在通過RNA干擾(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)及小分子化學(xué)藥物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME2）抑制轉(zhuǎn)錄因子Blimp1在SLE中的高表達(dá)，觀察Blimp1被抑制后MRL-1pr狼瘡小鼠的24小時(shí)尿蛋白、外周血抗雙鏈DNA抗體、腎臟病理改變、淋巴器官病理腫大、漿細(xì)胞及雙陰性T細(xì)胞等SLE疾病特征的改變情況，同時(shí)分析抗體產(chǎn)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BCMA、XBP-1、J-

4、chain的表達(dá)變化情況，以探索抑制Blimp1在SLE中的作用及可能分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.購買MRL-1pr狼瘡小鼠，構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的Blimp1 siRNA（實(shí)驗(yàn)組）及空白載體（對(duì)照組），包裝并滴定慢病毒，尾靜脈注射MRL-1pr狼瘡小鼠3周后，提取小鼠PBMC中總RNA，RT-PCR檢測(cè)Blimp1、BCMA、XBP-1、J-chain、C-myc mRNA表達(dá)水平，western blot及IHC分析小鼠肝

5、臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)中Blimp1蛋白的表達(dá)及組織分布情況。同時(shí)考馬斯亮藍(lán)染色法分析實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠24小時(shí)尿蛋白水平，ELISA技術(shù)定期檢測(cè)外周血抗雙鏈DNA抗體水平，并用HE染色病理切片評(píng)價(jià)腎臟病理改變情況。
　　2.購買MRL-1pr狼瘡小鼠及B6正常小鼠，隨機(jī)等分為實(shí)驗(yàn)組（2-ME2處理）和對(duì)照組（DMSO處理），按組灌胃給藥4周，每周記錄小鼠體重及皮膚潰爛面積、生化儀器檢測(cè)隨機(jī)尿尿蛋白及尿肌酐水平，而后處死小鼠并記錄

6、小鼠淋巴器官重量、背部皮損面積評(píng)分和淋巴結(jié)腫大評(píng)分情況，qRT-PCR及western blot檢測(cè)小鼠Blimp1mRNA及蛋白表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.Blimp1 mRNA及蛋白在MRL-1pr狼瘡小鼠外周血、脾臟、腎臟及淋巴結(jié)中高表達(dá)，Blimp1 siRNA注射3周后，狼瘡小鼠外周血Blimp1表達(dá)水平和抗雙鏈DNA抗體水平分別下降78％和28％(p＜0.05)，同

7、時(shí)伴隨抗體分泌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子XBP-1、J-chain和BCMA mRNA水平下降。相比對(duì)照組，雖然Blimp1蛋白水平在Blimp1 siRNA處理狼瘡小鼠肝臟中未見明顯變化，但在腎臟、脾臟和淋巴結(jié)中分別下降95％、72％和47％(p＜0.05)。此外，在Blimp1 siRNA的作用下，狼瘡小鼠的腎臟病理改變減輕，24小時(shí)尿蛋白水平也顯著下降(p＜0.05)。
　　2.Blimp1在MRL-1pr狼瘡小鼠外周血、腎臟、脾臟中高表

8、達(dá)，2-ME2可顯著抑制狼瘡小鼠外周血中Blimp1 mRNA表達(dá)（△Ct值6.99±0.69 vs7.36±0.50，p＜0.05）、腎臟中Blimp1蛋白表達(dá)（OD值0.46±0.07 vs0.15±0.16，p＜0.05）、脾臟中Blimp1蛋白表達(dá)（OD值0.88±0.11 vs0.26±0.18，p＜0.05），并降低其尿蛋白/尿肌酐比值（0.77±0.29vs0.27±0.17，p＜0.05）、抑制其脾臟的過度增生腫大（脾臟

9、/體重比值11.91±2.59 vs7.04±3.30，p＜0.05），減少狼瘡小鼠致病性T細(xì)胞數(shù)量（CD3+CD4-CD8-細(xì)胞數(shù)量11.93±2.70×106 vs2.13±1.74×106，p＜0.05），同時(shí)降低小鼠背部皮損面積大小及評(píng)分和淋巴結(jié)腫大評(píng)分、緩解其腎臟病變。
　　結(jié)論：
　　我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Blimp1在SLE患者中高表達(dá)，并與SLE疾病活動(dòng)度、自身抗體滴度及漿細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)。本次研究證實(shí)Blimp1在

10、MRL-1pr狼瘡小鼠中高表達(dá)，Blimp1 siRNA可顯著降低狼瘡小鼠Blimp1 mRNA及蛋白表達(dá)水平、24小時(shí)尿蛋白及外周血抗雙鏈DNA水平，緩解其腎臟病變。2-ME2可抑制MRL-1pr狼瘡小鼠腎臟、脾臟、外周血中高表達(dá)的Blimp1，降低狼瘡小鼠隨機(jī)尿尿蛋白/尿肌酐比值、抑制脾臟及淋巴結(jié)過度增生、減少其脾臟中致病性T細(xì)胞數(shù)量并緩解其腎臟病理改變，提示抑制Blimp1可以緩解狼瘡小鼠的SLE癥狀，其作用的產(chǎn)生機(jī)制可能是通過抑