細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究.pdf

1、該文作為吉林省科技廳"深層發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸"課題的部分內(nèi)容,對(duì)細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸進(jìn)行了有益的探索,主要完成了以下工作,并得到了相關(guān)結(jié)論.1、確定了有效的菌種篩選方法,從140份牛鼻粘膜中成功地篩選到了三株產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株,為生產(chǎn)透明質(zhì)酸奠定了基礎(chǔ).在初篩過(guò)程中,該菌株經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)后的形態(tài)觀察及莢膜染色鏡檢,證明為帶有莢膜的乙型溶血性鏈球菌.在復(fù)篩過(guò)程中,利用紅外吸收光譜法以目的代謝產(chǎn)物即透明質(zhì)酸為目標(biāo),以Sigma公司生產(chǎn)的透

2、明質(zhì)酸為標(biāo)樣進(jìn)行篩選.Sigma公司HA標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外譜圖與發(fā)酵液精提物的紅外譜圖各自吸收峰的位置和形狀基本相同,峰的相對(duì)強(qiáng)度相近.上述結(jié)果提示篩選菌株的產(chǎn)物呈較典型的HA紅外吸收?qǐng)D譜.2、確定了菌種誘變方法.紫外線誘變和亞硝基胍誘變,即物理誘變和化學(xué)試劑誘變相結(jié)合的復(fù)合處理,使血瓊脂平板上的菌落形態(tài)明顯變大,呈較大透明黏液狀,并得到一株不具有溶血性的突變菌.用紫外分光光譜法對(duì)發(fā)酵液精提物和標(biāo)樣透明質(zhì)酸的水溶液進(jìn)行分析,發(fā)酵液精提物的紫

3、外光譜在196nm處有特征吸收,與Sigma標(biāo)樣的相同.并且隨著HA含量的增加吸光度值也變大,表明利用其最大波長(zhǎng)處紫外光譜分析可以作為衡量發(fā)酵液中HA含量多少的依據(jù).但發(fā)酵液中提取物在257nm和280nm處存在紫外吸收,這表明發(fā)酵液中提取物較Sigma標(biāo)樣存在核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì).將誘變處理前后的菌株發(fā)酵液精提物分別在波長(zhǎng)196nm處進(jìn)行紫外分光測(cè)量,其吸收分別為1.813和2.071.表明誘變后透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提高幅度不大.3、確定了菌

4、株種子培養(yǎng)基的最佳組成.基于菌體生長(zhǎng)和透明質(zhì)酸合成相偶聯(lián),選擇透明質(zhì)酸的產(chǎn)量為試驗(yàn)指標(biāo),進(jìn)行了碳源,氮源,碳氮比,有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮協(xié)同作用對(duì)應(yīng)指標(biāo)的單因素試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果表明在其它控制條件不變的情況下,以2﹪葡萄糖作為碳源,蛋白胨和酵母膏作為氮源,碳氮比為1:1,有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮的經(jīng)為5:1時(shí),試驗(yàn)指標(biāo)最高.4、確定了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成.同樣選擇透明質(zhì)酸產(chǎn)量作為試驗(yàn)指標(biāo),以葡萄糖,蛋白胨和酵母膏,NaNO<,3>為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L

5、<,9>(3<'4>),通過(guò)對(duì)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和綜合實(shí)際,搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成確定為葡萄糖1﹪,蛋白胨1﹪,酵母膏1﹪,NaNO<,3>0.5﹪.通過(guò)對(duì)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化得到以蛋白胨和酵母膏復(fù)合氮源為主要成分的培養(yǎng)基,它們可以代替血清培養(yǎng)基,菌體的生長(zhǎng)良好.5、確定了菌株的最佳培養(yǎng)條件.繪制出種子培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)曲線,取14-16h為接種的最佳種齡,發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳裝液量確定為20ml/250ml.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后,