糖多孢紅霉菌TetR家族調(diào)控基因SACE-3986的功能研究.pdf

1、糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)是一類能產(chǎn)生多種復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物的營(yíng)土棲生活的革蘭氏陽(yáng)性放線菌，紅霉素就是其中一類具有廣譜抑菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類的次級(jí)代謝產(chǎn)物。自臨床應(yīng)用以來(lái)，紅霉素類藥物就是我國(guó)廣泛使用的主要抗菌消炎藥物之一。近些年來(lái)人們?cè)谠S多其他鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了很多參與抗生素合成的TetR家族調(diào)控基因(SCO1712，SAV151等)，暗示著在糖多孢紅霉菌TetR家族中可能存在參與調(diào)控紅霉素生物合成

2、的基因。
　　本研究利用片段同源重組技術(shù)滅活SACE_3986基因構(gòu)建得到△SACE_3986突變株。先PCR分別得到SACE_3986基因兩側(cè)約1500 bp的上下游同源臂，然后將其插入到質(zhì)粒pUCTSR中硫鏈絲菌肽抗性基因tsr兩邊的相應(yīng)位置，構(gòu)建出質(zhì)粒pUCTSR△3986;再利用片段同源重組技術(shù)用tsr基因?qū)ACE_3986基因替換構(gòu)建出△SACE_3986?！鱏ACE_3986與出發(fā)菌株A226在30℃條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)

3、酵，通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵液的枯草芽孢桿菌抑菌分析初步探討其紅霉素產(chǎn)量的變化，發(fā)現(xiàn)相比于A226，△SACE_3986突變株的紅霉素產(chǎn)量顯著提高，初步的抑菌分析顯示SACE_3986基因可能是參與紅霉素生物合成的負(fù)向調(diào)控基因。
　　為了進(jìn)一步確定SACE_3986基因?qū)t霉素生物合成的影響，對(duì)△SACE_3986突變株進(jìn)行了基因回復(fù)與過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，將連接有SACE_3986基因片段的整合質(zhì)粒pIB139分別導(dǎo)入到△SACE_3986突變株和

4、A226中，pIB139空載體作為對(duì)照，得到回復(fù)菌株△SACE_3986/pIB1393986和對(duì)照△SACE_3986/pIB139以及過(guò)表達(dá)菌株A226/pIB1393986和對(duì)照A226/pIB139，HPLC檢測(cè)發(fā)酵結(jié)果顯示△SACE_3986/pIB1393986的紅霉素產(chǎn)量回復(fù)到A226的水平86.2％，而A226/pIB1393986的紅霉素產(chǎn)量比A226/pIB139降低了46.7％。上述這些結(jié)果表明SACE_3986是

5、參與紅霉素生物合成的負(fù)調(diào)控基因。
　　為了研究SACE_3986基因的缺失是否會(huì)影響菌株形態(tài)分化和菌體密度，對(duì)△SACE_3986突變株和A226的形態(tài)分化和生物量變化進(jìn)行了觀察和分析。結(jié)果顯示，相比A226該突變株的孢子形成無(wú)明顯變化;表明SACE_3986基因不參與調(diào)控孢子形成。而A226與該突變株的菌體長(zhǎng)勢(shì)基本同步，生物量變化無(wú)顯著差異;表明△SACE_3986突變株紅霉素產(chǎn)量的提高并非由于自身菌體密度的改變所致。
　

6、　進(jìn)一步在工業(yè)菌株WB中缺失SACE_3986，HPLC檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明在WB中缺失SACE-3986紅霉素產(chǎn)量提高37.6％-40.3％。說(shuō)明在工業(yè)菌株中SACE_3986同樣能夠調(diào)控其紅霉素產(chǎn)量。
　　為了探討SACE_3986基因與其上游臨近基因SACE_3985以及紅霉素合成基因簇上eryAI和ermE以及之間的關(guān)系，從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)△SACE_3986突變株和A226進(jìn)行了熒光定量分析;分析顯示，相比A226，△SACE_398

7、6中eryAI和SACE_3985基因的轉(zhuǎn)錄量分別提高3.7倍和5.7倍，ermE基因的轉(zhuǎn)錄量提高1.7倍，說(shuō)明突變株中紅霉素產(chǎn)量提高可能是由于上述三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄量增加所致。
　　對(duì)His6-SACE_3986蛋白進(jìn)行了體外表達(dá)純化來(lái)深入研究SACE_3986基因調(diào)控紅霉素生物合成的機(jī)制，將SACE_3986蛋白分別與eryAI啟動(dòng)子、ermE抗性啟動(dòng)子和SACE_3985-SACE_3986進(jìn)行EMSA分析，加入dI/dC為對(duì)照

8、。EMSA結(jié)果發(fā)現(xiàn)SACE_3986蛋白體外可以結(jié)合SACE_3985-SACE_3986基因間區(qū)，而不能直接與eryAI和ermE啟動(dòng)子結(jié)合;表明SACE_3986不能直接調(diào)控eryAI與ermE，而其作用的靶基因?yàn)镾ACE_3985，并且通過(guò)調(diào)控SACE_3985基因來(lái)間接控制紅霉素產(chǎn)量。
　　本研究通過(guò)整合型載體將SACE_3985基因引入出發(fā)菌株A226中來(lái)驗(yàn)證靶基因SACE_3985的功能，HPLC產(chǎn)量分析顯示靶基因過(guò)表