糖多孢紅霉菌A226-YA突變體構建及產(chǎn)物分析.pdf

1、紅霉素(erythromycin)是一類廣譜大環(huán)內酯類抗生素，主要由糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaerythraea)合成。同其它抗生素一樣，紅霉素在臨床上也出現(xiàn)了許多耐藥病原菌，開發(fā)針對耐藥性細菌的新藥已非常迫切?，F(xiàn)在推向市場的第三代紅霉素-酮內酯類(ketolides)抗生素是使用化學方法對紅霉素結構進行修飾完成。其結構上最大的特點將內酯環(huán)C-3位的L-克拉定糖(L-cladinose)替換成了羰基。因為羰基能避免

2、誘導大環(huán)內酯-林可酰胺-鏈陽霉素B(macrolide-lincosamide-streptograminB，MLSB)抗性，所以能大大提高對某些紅霉素抗性菌的活性。隨著分子生物學的發(fā)展和對抗生素生物合成過程分子機制的認識深入，組合生物合成方法漸漸成為探索合成新抗生素的方法之一。 紅霉素生物合成分為兩步：母核的合成及后修飾。母核的合成是以聚酮合成酶(polyketidesythase，PKS)來完成的。PKS是個復合酶系，由六套

3、結構和功能相近的模塊組成。紅霉素母核中C-3位羥基是由模塊6中KR6酶域決定的。用基因工程方法對KR6酶域的DNA序列進行敲除或替換可能會全部或部分地使KR6失活，使C-3位羥基變?yōu)橥?。位于KR6酶域催化活性中心的Tyr2699是個關鍵性氨基酸殘基，突變Tyr2699可以使KR6完全使活。本文通過同源重組方法突變KR6酶域Tyr2699的密碼子，構建可以合成DOEB而減少紅霉素合成的糖多孢紅霉菌A226突變體。 為了將KR6中

4、催化三聯(lián)體中Tyr2699(Y)密碼子TAC換成Ala(A)密碼子GCC，并保證有效的染色體整合和二次重組，突變位點兩側同源片段長度保持約500bp。以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板，用PCR技術擴增出突變位點兩側DNA片段。然后再用重疊PCR技術將擴增出其合成基因KR6酶域及其附近酶域中的Tyr2699密碼子TAC突變?yōu)锳la密碼子GCC的大約1000bpDNA同源序列，克隆到載體pWHM3上，構建了同源重組質粒pWHM3-YA。將p

5、WHM3-YA轉化到糖多孢紅霉菌A226原生質體中，然后篩選出pWHM3-YA整合到紅霉素合成基因上的整合體A226-pWHM3-YA-A和A226-pWHM3-YA-B。將篩選得到的整合體A226-pWHM3-YA-A在無硫鏈絲菌肽(Thiostrepton，Thio)的R3M斜面上至少生長兩代后，制備成原生質體涂R3M平皿，對不能在含Thio的R3M斜面上生長并無枯草桿菌抑制效應的菌株進行DNA序列分析，獲得了糖多孢紅霉菌A226的

6、突變菌株A226-YA-A和A226-YA-B。ZabspecFab質譜分析證實了A226-YA-A突變體合成了DOEB，沒有紅霉素的合成，至此，獲得了糖多孢紅霉菌A226的突變菌株A226-YA。質譜圖上未檢測到紅霉素的734m/z離子峰，說明KR6酶域催化活性位點的Tyr2699是個重要的氨基酸殘基，其側鏈酸性酚羥基是個關鍵的質子供體功能基團，突變Tyr2699可以完全使KR6失活；也未有2-脫甲基-3-脫氧-3-羰基-紅霉內酯B3

7、51.1m/z的離子峰，說明在糖多孢紅霉菌中進行染色體突變，可以避免不必要的副產(chǎn)物產(chǎn)生。 突變體A226-YA合成的3-脫氧-3-羰基-紅霉內酯B的產(chǎn)量仍然很低。為了探討影響DOEB生物合成產(chǎn)量的因素，對糖基轉移酶和合成酶基因功能進行了分析，來證明二次重組是否改變了除已測序之外其它DNA的結構。將EB作為補充物添加到A226-YA發(fā)酵液中時，發(fā)酵液能夠抑制枯草桿菌，薄層層析也證明A226-YA能夠將向培養(yǎng)基中添加的EB轉化成紅霉

8、素，說明糖基合成酶和轉移酶都保持完整，整個重組過程沒有破壞糖多孢紅霉菌A226染色體的其它合成基因和后修飾基因結構。那么染色體突變后菌體合成的DOEB產(chǎn)量低的可能情況有三種：一是即使改變KR6的1個氨基酸也可能使巨酮合成酶的空間結構改變，從而影響到巨酮合成酶活性；二是突變體合成的DOEB為B-酮長鏈脂肪酸產(chǎn)物，不是TE酶最佳底物，使TE催化反應的效率降低；三是染色體結構的改變使突變基因轉錄的mRNA或翻譯的蛋白酶對菌體來說是個異源體，被