糖多孢紅霉菌A226G-突變體的構(gòu)建及恢復(fù).pdf

1、紅霉素(erythromycin，Er)是由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代謝產(chǎn)物,為一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,包括紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素C(ErC)、紅霉素D(ErD)等,它們結(jié)構(gòu)相似,而且均有抑菌活性,其中ErA在臨床上具有廣泛的用途,其抑菌活性最高,而且毒性也最小。
　　在糖多孢紅霉菌中,負(fù)責(zé)紅霉素生物合成的基因均以單一拷貝、成簇形式存在于環(huán)

2、形染色體上,質(zhì)粒不參與紅霉素的生物合成。糖多孢紅霉菌紅霉素3"-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(EryG)是一種S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性甲基化酶,在ErA生物合成過(guò)程中對(duì)中間產(chǎn)物ErC和ErD進(jìn)行甲基化修飾,從而在提高紅霉素的活性和降低紅霉素的毒性方面起著重要的作用。
　　為研究糖多孢紅霉菌紅霉素EryG的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)提供一個(gè)體內(nèi)研究系統(tǒng),構(gòu)建了糖多孢紅霉菌紅霉素 EryG編碼基因 eryG失活的突變體 A226G-,在A226G-突變體

3、中eryG基因已徹底失活,其編碼產(chǎn)物EryG不再具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
　　以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模版,用重疊PCR方法擴(kuò)增出去除紅霉素EryG SAM結(jié)合位點(diǎn)DNA序列在內(nèi)290bp的約1600bp DNA片段,克隆到同源重組質(zhì)粒pWHM3中,構(gòu)建了pWHMΔeryG。PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pWHMΔeryG質(zhì)粒轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌A226中,通過(guò)染色體同源重組整合到eryG基因位點(diǎn)上,用PCR方法篩選出糖多孢紅霉菌

4、整合體A226::pWHM△eryGⅠ和Ⅱ。薄層層析(TLC)和質(zhì)譜(MS)結(jié)果表明在A226::pWHM△eryGⅠ中質(zhì)粒pWHMΔeryG整合在eryG基因刪除位點(diǎn)的上游,而在A226::pWHM△eryGⅡ中質(zhì)粒 pWHMΔeryG整合在eryG基因刪除位點(diǎn)的下游。糖多孢紅霉菌整合體A226::pWHM△eryGⅠ在無(wú)抗R3M斜面培養(yǎng)基上連續(xù)生長(zhǎng)三代后,制備原生質(zhì)體涂無(wú)抗R3M平板,用TLC、PCR和MS方法篩選出一株糖多孢紅霉菌

5、紅霉素eryG基因失活的突變體A226G-,此eryG基因突變體僅能生產(chǎn)中間產(chǎn)物ErC而不再合成末端產(chǎn)物ErA,從而說(shuō)明A226G-突變體中eryG基因已徹底失活,其編碼產(chǎn)物EryG不再具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
　　為克隆、表達(dá)糖多孢紅霉菌紅霉素eryG基因,以糖多孢紅霉菌A226基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出eryG基因序列,克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)上,構(gòu)建了pETG。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖多孢紅霉菌紅霉素eryG基因可

6、以在大腸桿菌BL21(DE3)中成功地表達(dá),隨后,將紅霉素eryG基因亞克隆至糖多孢紅霉菌染色體整合型表達(dá)載體pZMW上,構(gòu)建了pZMWG。PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pZMWG轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌A226G-突變體中,用PCR方法篩選出糖多孢紅霉菌基因工程菌株A226G-G+。TLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)eryG基因的功能補(bǔ)償,糖多孢紅霉菌突變體A226G-恢復(fù)了ErA的合成能力,但產(chǎn)量比出發(fā)菌株A226要低。
　　具有抗寄生蟲、病毒和細(xì)菌活性