糖多孢紅霉菌表達(dá)載體的研究.pdf

1、紅霉素(erythromycin)是糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代謝產(chǎn)物，為一類廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。紅霉素的發(fā)展已經(jīng)經(jīng)歷了三代。第三代紅霉素-酮內(nèi)酯類抗生素(ketolide)，不僅可以增強(qiáng)紅霉素的酸穩(wěn)定性，而且對許多耐藥性細(xì)菌具有殺死或抑制作用。當(dāng)前第三代紅霉素也是通過化學(xué)方法對紅霉素結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾完成的，現(xiàn)在人們正在用基因工程方法探索合成第三代紅霉素，以避開

2、煩瑣的化學(xué)修飾步驟。 紅霉素的生物合成包括兩個部分：紅霉素母環(huán) 6-脫氧-紅霉內(nèi)酯 B(6-deoxy-erythronolide B，6-dEB)的合成和6-dEB的后修飾。對糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素生物合成基因進(jìn)行改造，已經(jīng)合成了多種紅霉素類似物。為了對紅霉素類似物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾研究，需要能夠在糖多孢紅霉菌中有效表達(dá)外源片段的載體。 本實(shí)驗(yàn)室利用現(xiàn)有的質(zhì)粒和遺傳材料，構(gòu)建了糖多孢紅霉菌染色體整合型表達(dá)載體pZMW和游

3、離型多拷貝表達(dá)載體pZM。因大多數(shù)鏈霉菌質(zhì)粒的啟動子在糖多孢紅霉菌中都不能發(fā)揮作用，故利用糖多孢紅霉菌染色體上紅霉素抗性基因PermE啟動子作表達(dá)載體啟動子，并利用pSET152質(zhì)粒上鏈霉菌染色體整合位點(diǎn)(attP)和氨樸霉素抗性基因，構(gòu)建了表達(dá)載體pZMW。該載體帶有紅霉素抗性基因PermE啟動子、fd終止子、多克隆位點(diǎn)(MCS)、氨芐青霉素和氨樸霉素抗性基因、鏈霉菌染色體整合位點(diǎn)(attP)，載體大小為10260bp。 游離

4、型多拷貝表達(dá)載體pZM是可以在大腸桿菌、鏈霉菌和糖多孢紅霉菌中擴(kuò)增的穿梭型質(zhì)粒，帶有PermE啟動子、fd終止子、多克隆位點(diǎn)、硫鏈絲菌肽和氨芐青霉素抗性基因以及在大腸桿菌和糖多孢紅霉菌中復(fù)制的ColE1 ori和pJV1 ori復(fù)制子，載體大小9880bp。 表達(dá)載體pZMW和pZM最重要的功能就是表達(dá)外源基因，所以其穩(wěn)定性就顯得尤為重要。為此我們對pZMW和pZM進(jìn)行穩(wěn)定性研究。小量提取表達(dá)載體pZMW質(zhì)粒，制備糖多孢紅霉菌A

5、226原生質(zhì)體。利用PEG介導(dǎo)表達(dá)載體pZMW轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行傳代，共傳5-10代。小量提取pZMW轉(zhuǎn)化菌株的總DNA進(jìn)行穩(wěn)定性鑒定。提取pZM質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化糖多孢紅霉菌A226原生質(zhì)體，對轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行傳代，共傳5-10代。小量提取pZM轉(zhuǎn)化菌株的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。對表達(dá)載體進(jìn)行穩(wěn)定性研究表明pZMW和pZM可以在糖多孢紅霉菌中穩(wěn)定存在。染色體整合型表達(dá)載體 pZMW 具有兩個大腸桿菌復(fù)制子，導(dǎo)致質(zhì)粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定性，同時具有兩種

6、抗性基因，增大了表達(dá)載體的大小，不利于外源基因的表達(dá)。為了解決上述問題，我們通過PCR擴(kuò)增3’端BamH I位點(diǎn)突變的紅霉素抗性基因PermE啟動子，連接到pET-22b(+)上，再將pKA質(zhì)粒上fd終止子與之相連后插入多克隆位點(diǎn)，最后連接至EcoR I/EcoR V位點(diǎn)突變的pSET152質(zhì)粒上，構(gòu)建了糖多孢紅霉菌整合型表達(dá)載體pZW。該載體具有一個大腸桿菌復(fù)制子，一種抗性基因，比pZMW載體小2530bp。在糖多孢紅霉菌中，pZW可